[发明专利]人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法和应用

权利要求书

1.一种人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将胎盘洗净；沿胎盘边缘剪下已脱落的蜕膜，除去羊膜；

(2)将上述已去除羊膜的胎盘胎儿面绒毛膜及大血管一起分离，用生理盐水或PBS缓冲液清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，将与绒毛膜板连接的大血管剪下；

(3)胎盘绒毛膜组织的分离及冻存：将绒毛膜板纵向剪成条形片，条形片的宽度、厚度各为0.5cm～2cm，长度为3cm～15cm；

将剪成的条形片放入冻存袋或冻存管，按下述方式加入冻存液：首先，4℃条件下，加入冻存液1，平衡5min；其次，0℃条件下，加入冻存液2，平衡15min；最后，加入冻存液3；三次加入的冻存液的体积比为3:1:1；然后，转入程序降温仪，按照设定的降温程序降温至-80℃～-90℃，转移至液氮冷冻保存；

所述降温程序为：降温至4℃，保持2min；以1℃/min速率降低至0℃，保持10min；10min内降温至-10℃，保持10min；45min内降温至-40℃，然后在2min内降至-90℃，保持5min；

所述冻存液1，由MEM缓存溶液和二甲基亚砜组成，其中，二甲基亚砜占8wt％；

所述冻存液2，由MEM缓存溶液、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，其中，二甲基亚砜占8wt％，右旋糖酐40占60wt％；

所述冻存液3，由质量浓度为20％的人血白蛋白溶液、二甲基亚砜、丙二醇、羟乙基脲和海藻糖组成，其中，各组分所占比例为：二甲基亚砜8wt％，丙二醇6wt％，羟乙基脲6wt％，海藻糖6wt％，余量为人血白蛋白溶液。

2.一种人胎盘绒毛膜组织的复苏方法，其特征在于：将利用权利要求1所述的人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法冷冻保存的胎盘绒毛膜组织从液氮中取出，放置气相10min平衡后迅速将冻存袋或冻存管置于37℃～42℃水浴锅中；溶解后迅速将冻存袋或冻存管转移至安全柜或超净台中，打开冻存袋或冻存管，用镊子轻轻取出胎盘绒毛膜，放入4℃的三倍基准浓度复苏液中，平衡1分钟，取出，再放入4℃的二倍基准浓度复苏液中，平衡1～3分钟，取出，再放入4℃的一倍基准浓度复苏液中，平衡3分钟用4℃的生理盐水或PBS溶液冲洗2～5遍，放入4℃的生理盐水或PBS溶液中，静置；

所述复苏液，由海藻糖、右旋糖酐40、丙氨酸、甘氨酸及羟乙基淀粉氯化钠注射液组成，使用时由羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基作为溶剂调整浓度；

一倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占5wt％，右旋糖酐40占6wt％，丙氨酸占3wt％，甘氨酸占3wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基；

二倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占10wt％，右旋糖酐40占12wt％，丙氨酸占6wt％，甘氨酸占6wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基；

三倍基准浓度复苏液中各组分的浓度为：海藻糖占15wt％，右旋糖酐40占18wt％，丙氨酸占9wt％，甘氨酸占9wt％，余量为羟乙基淀粉氯化钠注射液或MEM培养基。

3.胎盘来源的组织或细胞资源样本库的建立方法，其特征在于：利用权利要求1所述的人胎盘绒毛膜组织的制备冻存方法处理人胎盘并储存。