[发明专利]一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

A.目的基因的扩增：提取肺炎链球菌R6基因组，以所述基因组为模板，采用引物P1和P2进行基因扩增，得到二氢叶酸还原酶基因，即目的基因，所述二氢叶酸还原酶基因的序列为SEQID NO:1所示的核苷酸序列，所述引物P1的序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，所述引物P2的序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

B.重组克隆菌株的构建：将扩增得到的二氢叶酸还原酶基因回收后连接到pEASYTM-T1Simple克隆质粒上，得到重组克隆载体，将重组克隆载体转化到Trans1-T1感受态细胞中，筛选阳性重组克隆菌株，并进行鉴定；

C.重组表达菌株的构建：将阳性重组克隆菌株过夜培养后进行质粒提取，将提取到的重组克隆质粒进行NdeI和XhoI双酶切，得到二氢叶酸还原酶基因，将二氢叶酸还原酶基因连接到进行相同酶切处理的表达载体pET-28a上，得到重组表达载体pET-28a-dhfr，将重组表达载体pET-28a-dhfr转化到大肠杆菌BL(DE3)中，筛选后得到高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株；

D.重组二氢叶酸还原酶的诱导表达：将重组表达菌株进行培养，并向培养液中添加IPTG，诱导重组表达菌株表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶。

2.根据权利要求1所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤A中，基因扩增的反应条件为：94℃预变性5min后；进行30个扩增反应循环，每个反应中条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。

3.根据权利要求1所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤D具体包括以下步骤：挑取重组表达菌株至含有30μg mL^-1的卡那霉素的培养液中，37℃，200rpm过夜培养，将过夜培养的菌液用液体培养基稀释100倍后培养至OD值为0.5-0.8时，向培养液中加入0.5-1M IPTG，16-28℃条件下诱导5-16h，4℃条件下对培养液进行离心，收集菌体沉淀，用重悬缓冲液对菌体沉淀进行重悬后进行超声破碎，对悬液进行离心并收集上清液。

4.根据权利要求3所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述D步骤中，当所述OD值为0.6时，向培养液中加入0.5mM IPTG，16℃条件下诱导15h。

5.根据权利要求4所述的肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，在步骤D之后，进行以下的步骤E：

E.重组二氢叶酸还原酶的纯化：对上清液进行镍离子亲和层析，先后采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱，得到纯化的重组二氢叶酸还原酶，进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述重悬缓冲液为由20mM Tris-HCl、500mM NaCl、5-15mM咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液为由20mM Tris-HCl，500mM Nacl，15-25mM咪唑组成的水溶液，洗脱缓冲液为由20mMTris-HCl，500mM NaCl，450-550mM咪唑组成的水溶液。

7.根据权利要求6所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法，其特征在于，所述步骤E中，所述重悬缓冲液为由20mM Tris-HCl、500mM NaCl、10mM咪唑组成的水溶液；所述洗涤缓冲液由20mM Tris-HCl，500mM NaCl，20mM咪唑组成的水溶液，所述洗脱缓冲液为由20mM Tris-Hcl，500mM NaCl，500mM咪唑组成的水溶液。

8.一种高效表达重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株采用如权利要求1或2所述的制备方法得到。

9.如权利要求1-7中任一项所述的重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶在磺胺增效剂类药物多残留检测方法中的应用。