[发明专利]一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法

说明书

本发明公开了一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法。首先通过设计指示探针RP和捕获探针CP分别与目标物DNA‑7a两端互补，磁珠标记捕获探针形成MB‑CP结构，金纳米标记识别探针形成Au‑RP结构。在目标物核酸的存在情况下，磁珠上修饰的捕获探针以及金纳米修饰的识别探针分别与目标物的两端完全互补，形成“三明治”复合物结构，利用金纳米良好的催化作用，用银染增强的方式实现信号的放大，经磁性分离，硝酸消解沉积在金纳米上面的银后，再通过差分脉冲溶出伏安法检测其信号，从而定量检测目标物。该方法选择性好、灵敏度高、仪器简单，在遗传疾病的临床诊断中有着重大的实际意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术

现知的人类疾病都与基因有着直接或间接的关系, 核酸的检测和分析在遗传性疾病、传染病和肿瘤等领域的应用日益广泛，所以建立一种高灵敏度、高选择性和特异性的检测方法具有十分重要的意义。以往的方法大多建立在标记放射性元素、荧光以及电化学发光物质的探针与目标物序列的杂交的体系上。但由于其试剂价格昂贵，且需要的实验环境以及设备要求高等方面加大限制了其应用。所以建立一种高灵敏度、高选择性的检测方法极其必要。

随着纳米技术的发展，纳米金的应用得到了广泛的关注。金纳米粒子（AuNPs）有着其独特的物理和化学性质，如极高的消光系数、稳定的化学性质、优异的荧光淬灭能力以及显著的催化作用，使其成为了纳米科学研究中不可分割的一部分，纳米金作为标记物，广泛应用于蛋白质、癌症标记物、免疫球蛋白以及寡核苷酸的检测。硫醇化的DNA修饰AuNPs的在生物分析、诊断方面更是受到广泛的重视，DNA-AuNPs结构稳定，更是具有优秀的单碱基错配特异性识别能力。同时，由于金纳米良好的催化功能，使用银染的方式沉积银进行信号的扩大取得了不错的结果，在遗传疾病的临床诊断中起到了重大的实际意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法。

具体步骤为：

（1）纳米金合成制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行。通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。

（2）金标记识别探针（Au-RP）的制备：移取60 μL 浓度为10 μmol/L巯基修饰的DNA识别探针（RP）加入60 μL含10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦（TCEP）浓度为10 mmol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中活化2小时，活化完毕后加入1 mL步骤（1）合成的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着分别往里加入11.3 μL质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使最终质量百分比浓度为0.1 %，加入125.7μL浓度为0.1mol/L pH 7.4 PBS溶液，使其最终浓度为10 mmol/L，再加入66.16μL浓度为2 mol/L 的NaCl，使其最终浓度为0.1mol/L。在孵育24小时后使用高速离心机离心（10000 转/分钟，20分钟），分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1 mL 含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/LpH 7.4 PBS溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中储存备用。