[发明专利]一种检测稻曲病病菌的方法

权利要求书

1.一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：

(1)将已知的稻曲病菌株活化培养后收集菌丝球，滤纸吸干菌丝外表水分，放入-20℃冰箱储存备用；

(2)菌丝冷冻干燥后采取CTAB法提取DNA，检测提取DNA的浓度和纯度，之后将检测的DNA样品放入-20℃冰箱保存备用；

(3)采用随机引物对供试菌株DNA进行PCR扩增，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，80V电泳45min后切胶回收DNA；

(4)将回收的稻曲病菌特异性随机引物扩增片段与pGEM-T载体连接后转入大肠杆菌DH-5α中；

(5)采用菌落PCR筛选阳性单克隆，单克隆摇菌培养后提取质粒，对插入片段测序；

(6)将测序后的序列输入NCBI核酸数据库作BLAST分析，与GeneBank中己有序列进行同源性对比，验证序列为稻曲病菌的特异性序列，采用Primer 5.0设计病菌分子检测的特异性SCAR引物；

(7)在稻曲病发生的田块，于水稻黄熟期，采集病穗的谷粒，70％乙醇浸泡1min，无菌条件下分别剥取病穗谷粒颖壳和健穗谷粒颖壳各1g，CTAB法提取DNA，将提取的DNA测定浓度并稀释后作为DNA模板；

(8)采用SCAR引物对待测稻曲病菌DNA进行扩增，产物进行1.6％琼脂糖凝胶电泳，恒压80V电泳45min，紫外下在400bp处出现条带即为稻曲病菌鉴定阳性。

2.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于：所述随机引物为随机10聚体寡聚核苷酸，选用对稻曲病菌DNA能够扩增出稳定多态性条带的随机引物。

3.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，所述随机引物扩增的体系为：引物1μL、DNA模板2μL、5×Taq MasterMix 5μL、ddH₂O 17μL。

4.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，所述随机引物扩增的反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；51℃，45s；72℃，45s，35循环；72℃，7min，4℃保存。

5.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，所述稻曲病菌株活化培养方法为：在马铃薯琼脂蔗糖培养基上培养10d后，沿菌落边缘切取菌丝3块转接到装有100mL的马铃薯蔗糖液体培养基的三角瓶内，于28℃，160rpm摇床上振荡培养8～9d，直接用纱布过滤，无菌水冲洗2～3次，收集菌丝球。

6.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，所述SCAR引物对待测稻曲病菌进行扩增鉴定的体系为：1μL上游引物，1μL下游引物，1μL DNA模板，5μL DreamTaqGreen PCR Master Mix(5X)和17μL双蒸水。

7.根据权利要求1中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于，所述SCAR引物对待测稻曲病菌进行扩增鉴定的反应条件为：95℃，5min；95℃，40s；53℃，50s；72℃，45s，35循环；72℃，10min，4℃保存。

8.根据权利要求3或7中的一种检测稻曲病病菌的方法，其特征在于：DNA模板的浓度为200ng/μL。