[发明专利]一种高通量单细胞测序文库构建方法

说明书

本发明公开了一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，S1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于4℃至约25℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含30％‑40％的G或C；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子A。本发明设计巧妙，方法合理，高通量测序文库，效果好，准确性高，适合推广。

技术领域

本发明涉及单细胞测序文库构建技术领域，尤其涉及一种高通量单细胞测序文库构建方法。

背景技术

非基于培养的单细胞基因组学技术已成功实现，并被应用于各种微生物生态学研究。而对微生物细胞进行分析的难点在于，大多数微生物，如细菌和古细菌细胞，有着难以有效裂解的细胞外膜结构；原核微生物的RNA半衰期短、稳定性低；此外，细胞大小远小于哺乳动物细胞(10～30皮克)，因此细胞内的RNA分子的总浓度很低，大约为每个细胞4～10菲克,这一RNA浓度远低于真核生物细胞中的RNA浓度，为RNA抽提和分析提生了很多挑战。虽然针对真核生物单细胞的全转录组分析技术已经建立，但针对原核微生物单细胞的全转录组分析的技术一直没能够完全建立。

生物可以根据构成的细胞数目分为单细胞生物和多细胞生物。单细胞生物只由单个细胞组成，而且经常会聚集成为细胞集落。地球上最早的生物大约在距今35亿年前至41亿年前形成，原核生物是最原始的生物，如细菌和蓝绿藻且是在温暖的水中发生。单细胞生物包括所有古细菌和真细菌和很多原生生物。根据旧的分类法有很多动物，植物和真菌多是多细胞生物。变形虫算作单细胞动物，它的一些种类却算作粘菌，带鞭毛的鞭毛虫如眼虫有时被归为单细胞藻类或者是单细胞动物。

经检索，专利号为CN201310481921.X提出一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法，微生物单细胞的分离：将新鲜微生物细胞培养样本，在常温下离心收集，立即悬浮于RNA保护剂RNALater溶液中；使用显微注射系统在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的微生物单细胞重悬于RNALater溶液中，如总RNA抽提，总RNA的线性扩增，以及用于RNA测序文库的构建的多种商业试剂盒的应用效果比较评价，获得了一套完整的技术流程，最终实现了对微生物单细胞进行基于二代测序技术的全转录组分析，仅可以实现对不同微生物细胞个体间的基因表达差异的分析，还可以实现对极端环境下不可培养的微生物进行单细胞水平的生理功能分析；该申请文件在构建测序文库时，假阳性率不能通过简单地增加测序深度而减少，扩增错误是独立产生的，并可在线性扩增产物中稀释，为此，本发明提出一种高通量单细胞测序文库构建方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高通量单细胞测序文库构建方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种高通量单细胞测序文库构建方法，包括以下步骤，

S1，将来自所述单细胞的核酸接触第一物质和包含链置换活性的聚合酶，接触发生于4℃至约25℃温度范围的条件下，引物与所述核酸退火，且所述引物通过酶切得到延伸，其中所述第一物质包括富含30％-40％的G或富含30％-40％的C；和包含限制性内切核酸酶位点，从而产生包含引物退火的核酸模板的混合物；对引物退火的核酸模板进行两轮或更多轮延伸、解链和退火步骤，由此产生核酸模板、线性产生的半扩增子和非线性产生的全扩增子的混合物；将所述混合物置于使全扩增子的两个末端能够彼此退火的条件下，从而产生成环的全扩增子；将所述成环的全扩增子接触限制性内切核酸酶，从而使得全扩增子不能与第一物质或第二物质退火，其中第二物质富含30％-40％的G或C；以及使第一物质或第二物质与混合物中剩余的线性产生的半扩增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不会进一步解链的情况下发生，由此产生线性产生的全扩增子A；