[发明专利]一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法

权利要求书

1.一种含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体为在植物表达质粒载体的C端含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体。

2.根据权利要求1所述的含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体包含有三段编码FLAG蛋白标签Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的基因片段，所述三个FLAG蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体，其特征在于，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种构建权利要求1-3任意一项所述含有FLAG蛋白融合标签的植物表达质粒载体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)以pCAMBIA1302为出发质粒，采用SpeI和Eco065I酶切该质粒，通过凝胶电泳切胶回收9802bp的片段；

(2)全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列，全序列合成包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

(3)设计用于扩增包含编码3个FLAG蛋白的核苷酸序列基因片段的扩增引物，上游引物如SEQ ID No.6所示，下游引物如SEQ ID No.7所示；采用New England Biolabs的PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase进行扩增反应，扩增体系：50微升的总体积，包括10微升的5X Phusion HF Buffer、1微升的10mM dNTPs、2.5微升的10微摩尔上游引物、2.5微升的10微摩尔下游引物、1微升的上述合成的包含编码3个FLAG蛋白、浓度为45纳克/微升核苷酸序列基因片段、32.5微升的超纯水和0.5微升的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；扩增程序：98℃运行30秒；然后30个循环的：98℃运行10秒；60℃运行30秒；72℃运行10秒；最后72℃运行10分钟；

(4)扩增后最终在全序列合成的基因片段的N端加上SpeI酶切位点，在C端加上Eco065I酶切位点；用SpeI和Eco065I酶切该合成片段，凝胶电泳后切胶回收该片段；最后利用T4DNA连接酶连接上述酶切后回收纯化的片段；将连接反应的产物，热激转化DH5α,通过PCR鉴定得到阳性克隆；质粒载体的序列通过测序验证。