[发明专利]一种植物根内生细菌DNA的提取方法

说明书

本发明公开了一种植物根内生细菌DNA的提取方法，包含以下步骤：(1)样品前期处理：将包含植物根部组织的土柱样品冷冻干燥；(2)去除植物根系松散土壤，使得植物根表面附着的土壤厚度为1‑2mm；(3)将经步骤(2)处理后的植物根放入装有PBS缓冲液的离心管中，洗涤、超声处理，获取植物根，随后低温保存；(4)将步骤(3)处理的植物根研磨、均质；(5)取步骤(4)得到的样品，提取植物根内生细菌DNA。本发明极大减少植物根际部分细菌DNA对根内生细菌DNA的污染，分离操作行之有效，提取步骤简单易行，提取纯度高，省略了纯化步骤，安全实用，提高了植物根内生细菌DNA的提取效率和纯度。

技术领域

本发明涉及一种生物高分子提取方法，特别涉及一种植物根内生细菌DNA的提取方法。

背景技术

植物根际及内生细菌群落是植物根际微生态系统的组成成分，植物根际微生物与植物有着非常密切的相互关系，植物根际及内生微生物具有提高植物获取营养物质的能力，促进植物生长，帮助植物抵御植物病原体，提高植物对生物、非生物胁迫的抵抗力等作用。了解植物根际及内生细菌的组成和多样性，对于探究植物根际微生物的群落构建机制和植物根际不同部位微生物之间的相互作用关系具有重要意义。

但是将植物根际及根内细菌分离是个难点，主要原因是植物根际土壤与根部难以分离。以往对于植物根部内生细菌DNA的提取，预处理一般是使用酒精、无菌水进行多次清洗，然后进行研磨均质，这种方法实际上很容易使附着于根表面的细小土壤颗粒和微生物不能完全被去除，使得提取的根内生细菌DNA被来自根际部分的细菌DNA污染，导致提取纯度不高；其次现有的根内生细菌DNA提取完毕一般需要进行纯化，耗时耗力，大大降低了提取效率。

现在关于植物内生细菌的提取方法多样，但都存在内生细菌DNA可能被污染的问题，为了能满足植物内生细菌DNA提取之后研究和操作的要求，行之有效、高质量分离植物根际部分与根内生部分并提取出根内生细菌DNA是很有必要的。

发明内容

发明目的：本发明针对无有效方法可分离植物根际细菌与根内生细菌，提出一种有效、提取步骤简单易行、提取纯度高的植物根内生细菌DNA的分离、提取方法。

技术方案：本发明所述的一种植物根内生细菌DNA的提取方法：包含以下步骤：(1)样品前期处理：将包含植物根部组织的土柱样品冷冻干燥；(2)去除植物根系松散土壤，使得植物根表面附着的土壤厚度低于1-2mm；(3)将经步骤(2)处理后的植物根放入装有PBS缓冲液的离心管中，洗涤、超声处理，获取植物根，随后低温保存；(4)将步骤(3)处理的植物根，研磨、均质；(5)取步骤(4)得到的样品，提取植物根内生细菌DNA。

步骤(1)中，包含植物根部组织的土柱样品经冷冻干燥后，在超净工作台上进行操作。

步骤(2)中，将经过步骤(1)冷冻干燥的样品，先采用“抖根法”抖落根部(包括须根)四周松散的土壤，通过无菌手套揉搓和摇动从根部手动除去松散的土壤，直至剩余约为1-2mm附着在根部的土壤。

进一步地，步骤(3)中，将含有根外厚度约1-2mm的土壤样品置于盛有PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)的离心管中进行洗涤，洗涤的具体步骤为：用无菌钳搅动清除根表面所有土壤，涡旋振荡5-10分钟后，取出根部。在该步骤中，对洗涤根部的缓冲液进行离心分离，弃去上清液，洗下来的部分为根际部分，低温保存，可提取根际部分的DNA。

涡旋洗涤的目的是将附着于根部的土壤打散，针对附着于根部的大颗粒土壤。

优选地，洗涤次数大于两次，即所述根的内生部分经两次洗涤后，取出根部再放入新的含有35mLPBS缓冲液的50mL离心管中，进行后续处理。

进一步地，所述涡旋震荡的速度为3000r/min。