[发明专利]一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法

说明书

本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种基于结合原理的高通量药物筛选方法，包括以下步骤：（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白：（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；（4）磁性分离磁珠，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；（5）洗脱目标化合物，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小分子。（6）将与目标蛋白有结合作用的小分子进行进一步的生物活性验证。如果待测样品对该蛋白有生物调节的功能，则待测样品为阳性。该方法具有快速、成本低、节省样品量等特点，为发现靶标化合物提供新的筛选方法。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种镍离子螯合琼脂糖磁珠亲和层析原理高通量筛选蛋白配体的方法。

发明背景

传统的小分子抑制剂药物筛选方法是，先将测试的化合物逐一进行生物活性评价。这样的方法所用时间较长，筛选效率低，工作量大，成本高；随后发展的明胶酶谱法、放射性同位素法、高效液相色谱（HPLC）测定法、分光光度法等，各种方法均有相应的缺陷，如放射性同位素法则耗时长，对环境产生污染；HPLC测定法需要大量的流动相和昂贵的色谱柱等。因此开发快速、有效、操作简单和高通量的筛选方法是实现小分子抑制剂的必然趋势。

固定化金属螯合亲和层析技术是一种在近几年新发展起来的分离技术，原理是利用目标蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸等均可以与金属离子之间发生特殊的相互作用，如配价键结合等，从而可以把目标蛋白吸附在固定载体上，分离出来，而一般所用到的金属离子有Ni²⁺，Co²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺等，同时金属螯合亲和层析可能的抑制剂具有简单，吸附量大，分离条件温和等特点。

磁珠的结构通常由具磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分组成。由于磁核对外磁场的响应，磁珠可与磁铁吸附。当把磁铁移开，磁珠与磁铁分离。利用这一性质可以将磁珠从周围介质中迅速分离出来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微型化、通量高、灵敏度高的筛选蛋白质配体药物的方法。

一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法，包括以下步骤：

（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白；

（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；

（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；

（4）磁性分离，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；

（5）洗脱目标复合物，分子与蛋白结合的小分子，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小分子；

（6）将与目标蛋白有结合作用的样品进行进一步的生物活性验证。

上述步骤（1）中，其中所述亲和标签是His标签。

上述步骤（3）中，螯合的金属离子是Ni²⁺。

本发明的有益之处在于：本发明利用组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠与目标蛋白与筛选物的混合物结合，因而排除掉没有与目标蛋白的结合的小分子。洗脱蛋白与小分子结合复合物，分离小分子，然后将用质谱仪器鉴定目标小分子。最后，采用相应的药理学实验，验证目标小分子对该蛋白酶的活性的影响。如果待测样品对该蛋白有生物调节的功能，则待测样品为阳性。该方法具有快速、成本低、节省样品量等特点，为发现靶标化合物提供新的筛选方法。

附图说明

图1为基于结合原理高通量筛选蛋白酶配体的方法流程图；

图2为正离子模式下固相酶法筛选得到的化合物LC-MS分析结果。

图3 为HPLC方法对目标小分子的鉴定。

图4为二氢丹参酮I对ERp57蛋白酶活性的抑制作用。