[发明专利]一种靶向EGFR vⅢ的CAR-T细胞的制备方法及应用

说明书

一种靶向EGFRvⅢ且经基因修饰的CAR‑T细胞的制备方法及应用，包括将靶向EGFRvⅢ的氨基酸序列密码子进行优化，使之更适合在人源宿主体内表达，制备CAR‑T细胞；以及利用单碱基编辑的方法敲除CAR‑T细胞上的PD‑1基因；或组合分泌白细胞介素12(IL‑12)，用于促进活化的T细胞增殖；或组合分泌anti‑PD1抗体，用于结合其他T细胞上的PD1，解除肿瘤组织对T细胞的抑制作用。本发明选用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和导入基因的表达效率，并缩短操作时间，简化CAR‑T的制备程序，另外本发明敲除PD‑1基因时避免了使用病毒载体，安全性更高。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种靶向EGFR vⅢ的CAR-T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，是原癌基因C-erb-1(HER-1)编码表达的产物，分子量170KDa，EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，EGFR与其相应配体结合并活化，作为信号转导复合物，进而激活下游信号转导通路引起一系列细胞反应：促进信号传导和细胞生长分化、加速细胞周期进行及促进血管形成，促进肿瘤的生长和转移。

许多恶性肿瘤均呈现EGFR过表达，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，其通路的失调会导致多种人类上皮恶性肿瘤的发生，造成EGFR通路失调的原因包括EGFR的过表达，以及自身突变产生的持续激活。EGFRvⅢ(表皮生长因子受体Ⅲ型突变体)是表皮生长因子受体(EGFR)最常见的突变体形式，这种突变型缺失了正常EGFR第2到第7个外显子之间801个碱基对，而1和8外显子直接连接，且在连接处形成了一个新的甘氨酸，较EGFR野生型来说，EGFRvⅢ缺失了胞外段的6-273号氨基酸残基，即EGFR的配体结合区，其本身不和配体结合，即可产生持续的磷酸化，使受体产生持续的刺激信号，导致了EGFR通路的过度激活，EGFRvIII能提高肿瘤细胞致瘤性，促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡，以及改变细胞形态、提高细胞活力，降低细胞粘附性，使肿瘤细胞更具侵袭性。EGFRvIII是一种新型的肿瘤特异性靶点，除了广泛存在于胶质瘤外，在乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌等均有发现。

CAR-T则是一种通过把患者自己的防御细胞(T细胞)取出来，人工(依靠基因技术)加上一种能够识别癌症细胞的部件(癌细胞识别抗原受体)，并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。CAR分子主要包括胞外抗原结合区(Single chain antibody Fragment，ScFv)，用以识别肿瘤表面特定蛋白、跨膜区和胞内信号区。

如中国专利CN201610994507.2公开了一种自体CAR-T细胞制备方法及其应用，该发明将构建的CD28-CD137-CD19-CD3全长基因，用CRISPR/Cas9技术导入到患者T细胞制作成CAR-T细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗，与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性，提高了肿瘤的治疗效果。

再如中国专利CN201710217134.2公开了一种靶向治疗血液恶性肿瘤的CAR-T细胞的研究方法，包括以下步骤：构建CD19、CD20、CD33嵌合体抗原受体修饰的T细胞即CAR-T；建立GMP条件下的CAR-T构建和CAR-T细胞大规模制备工艺体系；建立CAR-T系统的安全性评价体系；筛选符合治疗适应症的患者；临床试验研究，该发明将比较基于转座子和转座酶的非病毒CAR-T技术在临床上的效果，为临床上推广更安全、成本低。