[发明专利]一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法

权利要求书

1.一种大球盖菇耐高温菌株的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）收集大球盖菇菌株或子实体，对收集的大球盖菇菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析，剔除亲缘关系较近的菌株，将剩余菌株作为供试菌株；

（2）将供试菌株进行菌丝耐高温递进式循环驯化，筛选出可在42℃条件下耐受6h的菌株作为大球盖菇耐高温驯化菌株；

（3）将步骤（2）筛选的大球盖菇耐高温驯化菌株接种于液体培养基中，静置培养，收集菌丝体，加入溶壁酶进行酶解，制备得到原生质体；

（4）将步骤（3）制备的原生质体进行高温再生试验，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株；

步骤（2）中，所述菌丝耐高温递进式循环驯化，具体为：将供试菌株在26℃培养16h，30℃培养8h，循环16次；以菌丝生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选，筛选出生长速度较快，长势良好的菌株，依次进行三个温度层次的循环驯化筛选，第一个温度层次为26℃，16h；34℃，8h；第二个温度层次为26℃，16 h；38℃，8h；第三个温度层次为26℃，16h；42℃，6h；每个温度层次的循环进行16次；

步骤（4）中，所述高温再生试验，具体为：调整步骤（3）制备的原生质体浓度，均匀涂布于再生培养基中，26℃恒温倒置闭光恢复1-2d后将温度升到34℃，继续恒温闭光培养

5d；挑取耐高温再生菌株，26℃培养5d后进行镜检，剔除掉其中的单核菌株，剩余菌株于26℃条件下培养5d后将温度调整至34℃，继续培养5d，再将温度调至26℃恢复培养5d；比较各菌株的生长速率，筛选出经过34℃培养后，菌丝长速较快、长势良好、异质性低的菌株作为耐高温菌株；

所述再生培养基的组成为：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉2.0g，磷酸二氢钾1.5 g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，0.6mol/L甘露醇1000.0 mL，琼脂20.0g。

2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤（1）中，通过SRAP分子标记技术对收集的大球盖菇菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析。

3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述液体培养基的组成为：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水1000.0 mL。

4.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述原生质体制备的条件为：收集菌龄为4d的菌丝体，按每100mg的菌丝体中加入1mL浓度为1.5%的溶壁酶，在32℃条件下酶解3h。

5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述原生质体的制备还包括纯化的步骤，即：酶解后过滤除去残留菌丝，滤液经3500r/min离心15min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤。

6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，在将步骤（3）制备的原生质体进行高温再生试验之前，还包括：将原生质体进行融合处理的步骤。