[发明专利]杂合抗菌肽PA-MO及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种杂合抗菌肽PA‑MO及其制备方法和应用。本发明通过对鱼源抗菌肽parasin I与moronecidin进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽parasin I与moronecidin进行拼接，中间加入蛋白Lingker，同时进行部分位点氨基酸突变，获得一种新型杂合抗菌肽PA‑MO，使其抗菌效力获得显著提高。将杂合抗菌肽PA‑MO基因进行毕赤酵母偏爱密码子优化后人工合成，克隆于毕赤酵母中表达，结果重组表达的杂合抗菌肽PA‑MO与原始抗菌肽相比抗菌效力获得显著提高。将重组菌株发酵规模放大到发酵罐水平，发酵液进一步纯化后可制成抗菌肽制剂，用于水产动物疾病的预防和治疗。

技术领域

本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽PA-MO及其制备方法和应用。

背景技术

随着抗菌肽结构与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试对天然抗菌肽进行设计改造，以期获得一批杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。目前，国内外已有多篇文献报道多种新型杂合抗菌肽，其抑菌效果明显优于天然抗菌肽，且生物安全性更高。

parasin I是从受伤鲶鱼粘液中提取的一种广谱抗菌肽，来源于组蛋白H₂A N末端的19个氨基酸，强力广谱抗菌，最小抑菌浓度可达到Buforin I的4倍、magainin 2的12倍，且无溶血活性。鱼源抗菌肽moronecidin分离于杂交斑纹鲈鱼，由22个氨基酸组成，能够广谱高效的抵抗鱼类致病菌，是一种具有开发潜力的抗菌肽。

本项目组以鱼源抗原肽parasin I和moronecidin为母本，通过蛋白质结构模拟、关键氨基酸替换等方法设计获得一种抑菌活性高和抗菌谱广的新型杂合抗菌肽PA-MO，可用于鱼类疾病的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1；

本发明还提供一种新型杂合抗菌肽PA-MO的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：

1）根据新型杂合抗菌肽PA-MO的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；

2）将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达新型杂合抗菌肽PA-MO的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肽PA-MO；

3）对重组表达的杂合抗菌肽PA-MO进一步浓缩、纯化后稀释分装，即为抗菌肽制剂。

本发明利用基因工程技术构建了能表达一种新型杂合抗菌肽PA-MO的重组酵母菌株。将重组杂合抗菌肽PA-MO制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前景和开发价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1 新型杂合抗菌肽PA-MO的获得

1、利用生物软件对抗菌肽parasin I（KGRGKQGGKVRAKAKTRSS）和抗菌肽moronecidin（GenBank登录号：AAV65044）进行空间结构分析，将抗菌肽parasin I的N端15个氨基酸与抗菌肽moronecidin的C端10个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker（GP），获得杂合抗菌肽PM，其氨基酸序列如下：

KGRGKQGGKVRAKAKGPGKTIHRLVTG