[发明专利]一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用，该方法包括以下步骤：(1)人工合成TLR2胞外区序列；(2)将TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选后得到重组质粒pET28a‑TLR2；(3)将重组质粒pET28a‑TLR2转化到大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达TLR2‑His重组蛋白；(4)将TLR2‑His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，即得。本发明制备的多克隆抗体的血清效价超过1:50000，具有特异性好、纯度高的特点，能特异性的检测到重组蛋白和组织内源性TLR2，制得的多克隆抗体为进一步研究TLR2的生物学功能提供有利的条件。

技术领域

本发明涉及一种抗体的制备方法，具体涉及一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

TLR2是TLRs家族的重要成员，主要表达在单核巨噬细胞表面，不仅介导对病原分子模式的识别，还能介导对热休克蛋白、透明质酸片段、纤黏连蛋白等内源性非感染抗原的识别，故TLR2不仅是连接天然免疫和获得性免疫的关键分子，而且在非感染性组织损伤及组织修复过程中有重要作用。

目前，哺乳动物与非哺乳脊椎动物如人、鼠、牛、猪和鸡等的TLR2结构与功能已有大量研究。现已证明，人、小鼠和牛TLR2基因CDS全长均为2355bp，编码784aa，其中C-端富亮氨酸重复序列(LRRs)54aa，TIR同源区145aa；猪TLR2基因CDS全长2358bp，编码785aa，其中C-端LRRs 51aa，TIR同源区145aa。Huang发现鸡TLR2有两种亚型，其中chTLR2-1基因CDS全长2382bp，编码793aa，TIR同源区145aa；chTLR2-2基因CDS全长2346bp，编码781aa，TIR同源区145aa。李国勤报道dTLR2基因编码区全长2382bp，由1个开放阅读框组成，编码793aa，其中亮氨酸为14.2％，含有24个氨基酸的信号肽序列，属于I型跨膜受体，其TIR同源区145aa，与chTLR2-1蛋白TIR区域相同。与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0％、63.5％、61.4％、60.0％和58.4％，表明dTLR2在物种中相对保守。

其他物种特别是模式动物中已有多种TLRs家族成员的抗体制备和功能研究，某些已经形成商业产品，但这一研究在家禽TLRs研究中，特别是水禽研究中未见报道。dTLR2抗体的制备和外源添加，能否阻断鸭机体中dTLR2信号通路，进而发挥其各种生物学效应，如抑制机体炎症应答能力，为研制生物大分子药物提供靶点，都是值得期待的研究方向。因此，研究鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法，具有重要的意义。

发明内容

为了解决上述现有技术的问题，本发明提供了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据TLR2的胞外区域的氨基酸序列，合成TLR2胞外区核酸序列，以该序列为模板扩增TLR2胞外区序列；

(2)将扩增得到的TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选含有目的片段的阳性克隆，得到重组质粒pET28a-TLR2；

(3)将重组质粒pET28a-TLR2转化到大肠杆菌BL21(DE3)，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2-His重组蛋白；

(4)将TLR2-His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，得到所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体。

其中，步骤(1)中，合成TLR2胞外区序列如SEQ ID No.1所示。

步骤(2)中，扩增所用的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所用下游引物序列如SEQ ID No.3所示。所述上下游引物序列中含有限制性内切酶EcoR1、HindШ的酶切位点。