[发明专利]一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法

权利要求书

1.一种富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：包括将耐高锌植物乳杆菌菌种用于富锌植物乳杆菌添加剂制备的步骤；其中，所述富锌植物乳杆菌添加剂的制备包括以下步骤：

S2.1、斜面菌种培养：将耐高锌富锌植物乳杆菌菌种划线接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值为5.5-7.0的改良MRS固体培养基上，培养温度35-40℃，厌氧培养36-48h；

S2.2、一级液体种子培养：通过灭菌的生理盐水将改良MRS固体培养基上的菌落洗下混匀，吸取2.5ml菌液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的250mL改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，厌氧培养15-24h，得到一级液体种子培养液；

S2.3、二级液体种子培养：将200ml一级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-500ug/ml、pH值5.5-7.0的15-30L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，培养5-10h，得到二级液体种子培养液；

S2.4、发酵罐培养：将20L二级液体种子培养液接种于糖含量2-5％、锌含量20-1000ug/ml、初始pH值5.5-7.0的1000-2000L改良MRS液体培养基中，培养温度35-40℃，转速10-50rpm，发酵过程中用碱控制pH5.0-6.5，培养8-16h，得到富锌植物乳杆菌培养液；

S2.5、将富锌植物乳杆菌培养液离心收集，得到的菌泥与保护剂进行乳化、冻干，经粉碎得到富锌植物乳杆菌添加剂。

2.根据权利要求1所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：所述耐高锌植物乳杆菌菌种经以下步骤获得：

S1.1、将植物乳杆菌采用涂平板的方法接种到含不同锌浓度的改良MRS固体培养基中上，以确定其锌离子的耐受性；

S1.2、以确定的锌离子耐受浓度为起始浓度，将植物乳杆菌接种到含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为一代；挑取固体平板上较大的菌落接入含锌离子的改良MRS液体培养基上进行培养，然后用接种环挑菌液在含相同锌离子浓度的改良MRS固体平板培养基上进行划线培养，此为二代。如此传代驯化培养40-60代；

S1.3、将驯化后的菌株进行分离筛选，接种到改良MRS液体培养基中培养，筛选出经过驯化后耐锌能力强的菌种并保藏，即为耐高锌植物乳杆菌菌种。

3.根据权利要求2所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：步骤S1.1和步骤S1.2中，改良MRS固体培养基和改良MRS液体培养基的糖含量为2-5％、锌含量为20-1000ug/ml、pH值为5.5-7.0、培养温度为35-40℃；改良MRS液体培养基厌氧培养12-24h，改良MRS固体培养基厌氧培养36-48h。

4.根据权利要求2所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：步骤S1.1中确定植物乳杆菌锌离子耐受性的条件为：培养36-48h后，单菌落直径小于0.5mm对应的锌离子浓度。

5.根据权利要求2所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：步骤S1.2中同一代的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基中锌含量相同，其中1-15代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为20-300ug/ml，15-35代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为300-600ug/ml，35-50代采用的改良MRS液体培养基和改良MRS固体培养基的锌含量为600-1000ug/ml。

6.根据权利要求2所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：当植物乳杆菌在改良MRS固体培养基上生长36-48h后，当菌落直径在1-2mm时，开始在培养基中提高锌含量。

7.根据权利要求1所述的富锌植物乳杆菌添加剂的制备方法，其特征在于：步骤S2.4中采用的碱为20-40％的碳酸钠或氢氧化钠。