[发明专利]一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法

说明书

本发明公开了一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法，该方法包括如下步骤：(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；(2)构建含L‑myc基因的重组慢病毒载体；(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；(4)选取合适浓度病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。本发明永生化细胞系的制备方法是一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略；制备的永生化人源神经干细胞系具有原代神经干细胞的所有生物学特征，同时也具有正常的三系分化特性，可以成功分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，同时该细胞系的生长速度及成神经球的能力较原代细胞强，成功传代20代以后依然可以快速增殖，并且无致瘤性。

技术领域

本发明属于细胞生物学及神经科学技术领域，具体涉及一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。

背景技术

神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)起初被认为只存在于出生前及出生后不久，近来证据表明其同样存在于成人的侧脑室下层和海马齿状回处，具有分化为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的多向潜能，能自我更新、具有低免疫原性和良好的组织相容性。由于NSCs可以提供各种神经细胞来维持和修复损伤的脑组织，因此被认为是治疗神经系统疾病的良好工具和最具希望的天然资源。众多临床前研究均已证实了移植外源性神经干细胞可以在疾病如缺血性脑卒中中具有一定的治疗效果。然而神经干细胞在进行临床转化之前还有一些实际关切的重要问题有待解决，其中主要的如细胞的代谢衰老问题，随着培养细胞的正常增殖、分化，体外培养难以获得大量的同质细胞，反复提取和输注细胞又同时增加了成本、安全和伦理问题。因此，目前研究认为对移植细胞进行永生化处理是一个很好的策略，可以为基础研究和临床转化提供大量的同质可靠的种子细胞。

永生化(immortalization)细胞是指细胞处于连续周期中而停止发育进程。目前细胞的永生化方法主要是通过基因改造，如通过病毒载体将编码癌基因蛋白的基因导入目的细胞中，使细胞获得长期传代的能力。目前对细胞进行永生化用的较多的方法是将不同形式的c-myc、p53、腺病毒EIA、端粒酶hTERT以及SV40大T抗原导入早期阶段的细胞内制成永生化细胞系，其中c-myc和SV40大T抗原的使用最为广泛。然而目前这些细胞永生化的方法还不够稳定，或者伴有潜在的致癌风险，如单独的hTERT基因导入或不足以永生化，联合SV40抗原又增加编码的复杂性和潜在致瘤风险。目前国际上使用的两株临床级永生化神经干细胞系HB1.F3.CD21NSCs和CTX0E03NSCs，均是在2006年前通过高度致癌基因v-myc/c-myc编码生成。近来研究逐渐发现myc基因中L-myc亚型也可以表现出一定的编码潜能，且比其他myc具有更低的肿瘤源性和稳定性。因此，我们计划研究利用新型的L-myc基因来对人源NSCs进行永生化编码，探讨编码后的永生化NSCs和原代NSCs间的生物学特性，发展一种新的安全有效的永生化编码策略，以满足未来神经干细胞的基础研究和临床转化需求。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种永生化人源神经干细胞系及其制备方法。本发明发展一种新的稳定且安全有效的永生化编码策略，利用新型L-myc编码基因来构建一种永生化的人源神经干细胞系，以满足未来在神经干细胞及神经系统疾病上的基础研究甚至临床转化需求，克服现有的技术不足及目前编码永生化细胞策略中的潜在致瘤风险。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种永生化人源神经干细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分离培养原代人海马来源神经干细胞；

(2)构建含L-myc基因的重组慢病毒载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MYCL-3Flag；

(3)对上述重组慢病毒进行包装生产及上清液收集；

(4)选取合适浓度慢病毒上清液对干细胞进行转染筛选及构建永生化人源神经干细胞系。