[发明专利]一种多功能纤维素酶基因及其应用

说明书

本发明涉及一种多功能纤维素酶及其应用，其包括内切葡聚糖酶结构域、外切葡聚糖酶结构域和β‑葡萄糖苷酶结构域，所述内切葡聚糖酶结构域、外切葡聚糖酶结构域和β‑葡萄糖苷酶结构域通过柔性接头连接；还涉及上述多功能纤维素酶的基因表达框的表达载体和表达宿主；还涉及使用上述多功能纤维素酶降解木质纤维素的方法。本发明首次构建了具有三种不同纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶)活性的多功能纤维素酶，该多功能纤维素酶的底物特异性酶活性和总纤维素酶活性都比原始的单酶显著更高。

技术领域

本发明涉及纤维素的微生物发酵领域，更特别地，涉及一种多功能纤维素酶基因及其应用。

背景技术

随着对能源需求的增长和对化石燃料弊端的担忧，木质纤维素因其丰富、可再生、不与人类需求竞争而受到广泛关注。木质纤维素主要有四大来源：森林残留物(木材、树枝、树叶等)、农业残余物(稻草、玉米秸秆等)、能源作物(芦竹、甘蔗等)和纤维素废物(食物废物和城市固体废物等)。木质纤维素主要由40-50％纤维素、25-30％半纤维素、15-20％木质素和少量果胶、氮化合物和无机成分组成。

纤维素酶作为木质纤维素降解酶中最大的一类酶，在纤维素降解过程中发挥了巨大作用。其完全降解过程需要三种切割位点不同的酶协同作用，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。随着对纤维素酶的广泛研究，这些生物催化剂被广泛应用于众多工业领域。考虑到对多种酶的协同作用的需求，单个细胞中多种酶的表达可能提高降解效率并减少生产工艺流程。许多单个细胞中表达多种基因的方法常常依赖于多种筛选方式并且操作复杂，例如共表达策略。目前，融合表达策略，可作为一种替代共表达的生物技术，也被用于同时表达多种酶，并且具有许多优点，包括克隆和转化的便利操作、高水平的可溶性表达、成本有效的纯化和升级的催化能力。已经有很多关于纤维素酶两两融合的报道，然而却没有关于三种或以上的纤维素酶催化结构域融合表达的报道。因此，为了减少多功能纤维素酶表达过程中复杂的操作，我们首次使用融合策略构建具有三种不同纤维素酶功能的单基因。将该基因在酿酒酵母中表达，筛选得到具有不同特异性酶活性的菌株，而且其滤纸酶活性(总纤维素酶活性)均显著高于相应的单一酶，该多功能纤维素酶基因可用于简洁的遗传操作。该多功能纤维素酶符合三种纤维素酶协同作用的降解模式，操作简单、效果明显，并且对多种其他类型的酶降解木质纤维素的过程具有借鉴意义，具有广泛的低成本应用价值。

发明内容

为解决以上问题，我们尝试构建具有三种不同纤维素酶结构域的编码框的单基因。研究过程中，测试了不同来源的纤维素酶组合，结果发现许多组合并不能表现有效的纤维素酶活性，推测可能是因为这些组合的结构域空间结构未能有效折叠产生具有催化功能的活性中心。本发明中，我们截取来之三种不同纤维素酶(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶)的催化结构域，利用柔性接头序列设计三催化结构域的三功能纤维素酶单基因序列，经异源表达得到了一个特定结构域组合的单基因三功能纤维素酶，该酶具有不同的特异性酶活性，而且滤纸酶活性均显著高于单一酶。

基于以上研究，本发明提供了一种多功能纤维素酶，其包括内切葡聚糖酶结构域、外切葡聚糖酶结构域和β-葡萄糖苷酶结构域，所述内切葡聚糖酶结构域、外切葡聚糖酶结构域和β-葡萄糖苷酶结构域通过柔性接头连接。

在一个具体实施方案中，所述柔性接头为如SEQ ID NO:4所示。

在一个优选实施方案中，所述内切葡聚糖酶结构域如SEQ ID NO:3所示，所述外切葡聚糖酶结构域如SEQ ID NO:2所示，所述β-葡萄糖苷酶结构域如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种多功能纤维素酶表达载体，其包含上述多功能纤维素酶基因表达框。

本发明还提供了一种表达多功能纤维素酶的宿主，其基因组中含有上述多功能纤维素酶基因表达框。

在一个具体实施方案中，所述宿主为酿酒酵母菌宿主。

本发明还提供了上述多功能纤维素酶在分解纤维素中的应用。