[发明专利]与工业制药应用相容的可放大的慢病毒载体生产系统

权利要求书

1.一种用于生产重组慢病毒载体的方法，其包括：

-在无血清培养基中悬浮培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒，所述培养在至少5L的体积中进行；

-从培养基中收获所产生的重组慢病毒载体。

2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是HEK293T细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中收获步骤由单次慢病毒收获组成。

4.权利要求3的方法，其中所述转染是瞬时转染，并且单次收获在转染后48至72小时之间实施。

5.权利要求1至3任一项的方法，其包括转染步骤，其中用聚乙烯亚胺(PEI)和质粒的混合物转染细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述PEI是20-25kD的线性PEI。

7.权利要求5或6的方法，其中利用至少1.5μg/10⁶个细胞的DNA总量进行转染。

8.权利要求5至7任一项的方法，其中在转染前将PEI和质粒依照少于10的N/P比率混合，其中N/P是指每个寡核苷酸磷酸的PEI氮原子数目。

9.权利要求8的方法，其中所述N/P比率为6左右。

10.权利要求5至9任一项的方法，其中在加入到细胞培养物中之前PEI和质粒之间的接触时间是在5至30分钟之间，接触时间具体地是10分钟左右。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中在细胞转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。

12.权利要求11的方法，其中丁酸钠以在培养物中2mM至12mM之间、具体地在2mM至10mM之间的终浓度，更具体地是5mM的终浓度加入到细胞培养物中。

13.权利要求1至12任一项的方法，其中用4种质粒转染细胞，所述4种质粒包括编码包膜蛋白的质粒(Env质粒)、编码慢病毒GagPol蛋白的质粒(Gag-Pol质粒)、编码慢病毒Rev蛋白的质粒(Rev质粒)以及在慢病毒3’-LTR和慢病毒5’LTR之间包含目标转基因(TOI)的质粒(TOI质粒)。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中所述培养在至少50L的体积中实施。

15.权利要求1至14任一项的方法，其中产生了至少10⁷个感染基因组/mL。

16.权利要求1至15任一项的方法，其中：

-细胞是293T细胞；

-利用PEI与所需质粒的混合物进行细胞的转染；

-在转染后24小时加入丁酸钠而不更换培养基；并且

-对所产生的慢病毒载体进行单次收获。

17.一种细胞培养装置，其中所述培养装置含有至少5L体积的无血清培养基，所述培养基中包含转染有至少一种适合于生产慢病毒载体的质粒的哺乳动物细胞，所述细胞在所述培养装置中悬浮生长。

18.权利要求17的细胞培养装置，其中所述细胞是HEK 293T细胞。

19.一种通过在无血清培养基中悬浮生长的哺乳动物细胞而对慢病毒载体的生产进行优化的方法，所述哺乳动物细胞转染有所述生产所需的质粒，所述方法包括在转染后24小时将丁酸钠加入到细胞培养物中而不更换培养基。

20.权利要求19的方法，其中所述丁酸钠以5mM的终浓度加入。