[发明专利]一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法

权利要求书

1.一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；

(2)钝性分离并清洗瘤胃组织；

(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；

(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；

(5)收集到的细胞沉淀清洗，完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；

(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。

2.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述瘤胃内容物先用灭菌的D-Hanks溶液冲洗干净，然后用含青链霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出现澄清为止。

3.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述钝性分离为用分离工具将黏附的浆膜层和肌肉层分离，再用含青链霉素的D-Hanks溶液冲洗。

4.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述将瘤胃组织裁剪后，用含青链霉素的D-Hanks溶液清洗，然后平铺在锥形瓶底部，再用添加三抗的胰蛋白酶和的乙二胺四乙酸消化。

5.根据权利要求4所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述三抗优选为青霉素，链霉素和庆大霉素。

6.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，消化时间短为2-3h；所述进行清洗为加含青链霉素的D-Hanks液清洗。

7.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述每隔5～6分钟收集一次细胞悬液，前2～3次的细胞悬液不收集，收集最后2～3次消化的细胞悬液。

8.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述最后2～3次消化的细胞悬液通过滤膜过滤后取上清液混合离心，离心条件转速为1000～1500rpm，时间为8～10分钟。

9.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述收集到的细胞沉淀用D-Hanks溶液清洗，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一，然后调节细胞密度至大于10⁶/ml，台盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到的培养瓶中。

10.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(6)所述铺层80％～90％左右时，用胰蛋白酶消化后可进行传代或者液氮保存。