[发明专利]醛酮还原酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种醛酮还原酶突变体及其在不对称还原6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第125位、30位、212位、63位进行单突变或多突变获得的。本发明制备的醛酮还原酶突变体pKlAKR‑I125V‑S30P‑Q212R‑I63W的比酶活较母本醛酮还原酶提升了1.31倍，最大底物6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯投料达到80g/L，该醛酮还原酶突变体更具工业应用前景。

技术领域

本发明涉及醛酮还原酶KlAKR突变体构建，开发醛酮还原酶重组菌和酶在阿托伐他汀侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成方面的应用。

背景技术

心脑血管疾病已经成为危害人类健康的主要疾病之一，心脑血管疾病发病与人体血液中胆固醇水平有密切关系。阿托伐他汀钙能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，减少胆固醇的合成，降低血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯浓度，是全球唯一累计销售额超过1000亿美元的单一降脂药品种。

6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙合成的重要双手性二醇中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值99％，d.e.值99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀钙合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸(酯)出发，通过硼烷不对称加氢还原构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷等试剂以及苛刻的反应条件，产物光学纯度低、得率低，过程能耗大、反应废弃物处理困难，属于非环境友好型生产方式。利用氧化还原酶不对称还原潜手性酮合成手性醇具有选择性高、反应条件温和、环境友好等技术优势，制造过程的经济性高，且符合绿色化学的要求。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术具有巨大的经济效益和社会效益。

醛酮还原酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，醛酮还原酶通常为约320个氨基酸组成单亚基蛋白，大小为34-37kDa，具有(α/β)₈筒状结构，其催化四联体由酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸和赖氨酸组成，底物谱宽，包括脂肪族、芳香族醛、酮、单糖等。

我们从乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis CCTCC M 2014380中克隆得到的醛酮还原酶KlAKR，并在大肠杆菌(Escherichia coli)实现异源过量表达，该酶能够催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，且de值大于99％，但该酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的活力不够高，通过定点突变技术获得了一株优势突变株KlAKR-Y295W-W296L已在专利申请(201610124451.5)中公开，能够在不添加外源型辅酶NADPH的情况下，80分钟内完全转化50g/L的底物，但发现该酶的活力、稳定性、底物投料量还有提升空间，本专利借鉴已报道的醛酮还原酶晶体结构信息，运用同源建模和分子模拟技术手段，确定KlAKR的空间结构、酶活性口袋附近的氨基酸位点，以及可能的底物进入、产物释放通道等，通过蛋白质工程技术提高醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力及底物负载，具有工业应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原活性不高及底物浓度低的问题，提供一种立体选择性醛酮还原酶突变体及利用该醛酮还原酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物合成，催化剂的活性提高了1.31倍，底物浓度提高了60％。

本发明采用的技术方案是：