[发明专利]筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法

说明书

本发明公开了筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法。本发明提供了一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。本发明提取了结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白，并进一步与HuProt^TM人类蛋白芯片进行杂交，获得了能够与结核蛋白发生相互作用的特异性人蛋白：84个人蛋白，这些特异性人蛋白将可能用于结核诊断和结核治疗。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法。

背景技术

结核病仍然是严重威胁人类健康、流行性最广、病死率最高的传染性疾病之一，每年全球约有1000万新发病例，160万人死亡，死亡人数居单一传染病之首。作为结核病的致病菌，结核分枝杆菌经过长期的演化已进化为非常成功的一种胞内致病菌。结核分枝杆菌通过呼吸道进入人体后，主要寄生于巨噬细胞内，并通过其多种策略逃避宿主细胞的免疫杀伤作用，可以在巨噬细胞内缓慢复制、长期存活，最终产生持留状态。当宿主免疫力低下时，休眠的结核分枝杆菌可以重新活化，导致机体发展为活动性结核病。结核分枝杆菌从进入宿主细胞直至宿主发病的过程中，激发了宿主体内复杂的免疫反应，一方面通过调节宿主免疫系统的平衡，使之更加适合于其在宿主体内寄生，另一方面在合适的环境下又可快速繁殖引发结核病，甚至最终导致宿主死亡。然而，结核病的感染及致病的分子机制依然不清楚。但毋容置疑的是，结核病感染和发病的过程也是结核分枝杆菌和宿主之间发生复杂的相互作用的过程，能够与结核分枝杆菌直接相互作用的宿主蛋白质是结核感染和致病的桥梁和关键，鉴定出这些特异性的人蛋白，将有助于深入揭示结核病发病的分子机制，也可为结核病的诊断和治疗提供潜在的药物靶点。

发明内容

本发明的目的是提供筛选特异性靶向结核分枝杆菌的人的配体蛋白的方法，以及所筛选到的人类蛋白的相关应用。

第一方面，本发明要求保护一种筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法。

本发明所提供的筛选能够与结核蛋白相互作用的人类蛋白的方法，可包括如下步骤：将来源于结核分枝杆菌的菌体蛋白和分泌蛋白分别与人类蛋白芯片进行杂交，根据杂交结果确定能够与所述菌体蛋白和/或所述分泌蛋白相互作用的人类蛋白。

在所述方法中，来源于所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白是按照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)结核分枝杆菌菌体蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的菌体重悬于PBS中，然后经反复冻融、超声、离心，所得上清即为含有所述菌体蛋白的溶液。

进一步地，将所述结核分枝杆菌的菌体重悬于PBS中之前，还可包括如下步骤：用PBS洗涤所述结核分枝杆菌的菌体(如洗涤2次)。所述反复冻融的次数可为3次。所述超声的条件可为：P＝800W，超声2秒，间歇2秒，共40分钟。所述离心的条件可为4℃12000rpm离心10分钟。

(2)结核分枝杆菌分泌蛋白的提取：将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌后进行超滤，超滤管中截留的液体即为含有所述分泌蛋白的溶液。

进一步地，将所述结核分枝杆菌的培养上清过滤除菌时可采用0.22μm滤器。进行所述超滤时可采用离心超滤管(3KD)。在进行所述超滤之后还可包括用PBS洗涤的步骤(如洗3次)。

更进一步地，在对所述结核分枝杆菌的所述菌体蛋白和所述分泌蛋白进行提取前还可包括如下步骤：将所述结核分枝杆菌接种到7H9液体培养基(美国BD公司，货号271310，含10％促生长添加剂OADC、0.5％吐温-80，％表示体积百分含量)中培养至对数生长期，然后进行灭活处理，离心收集上清和菌体；所述上清即为步骤(2)中的所述结核分枝杆菌的培养上清，所述菌体即为步骤(1)中的所述结核分枝杆菌的菌体。