[发明专利]一种颠茄AbPDS基因及其应用

说明书

本发明公开了一种颠茄AbPDS基因及其应用，AbPDS基因的DNA序列为SEQ ID NO.1。本发明首次克隆了颠茄AbPDS基因并实现了颠茄VIGS体系的构建。本发明通过在特异性引物中引入SacI和KpnI酶切位点，在烟草脆裂病毒TRV系统中插入来源于颠茄AbPDS基因序列770‑bp长度的片段。通过VIGS技术该片段实现了AbPDS基因表达沉默，从而抑制了颠茄叶绿素的生物合成，最终导致了叶片出现漂白现象。本发明首次克隆AbPDS基因并建立了颠茄的VIGS体系，为研究颠茄基因的生物学功能提供了可靠的技术保障。

技术领域

本发明属于VIGS技术体系领域，具体是一种颠茄AbPDS基因及其在构建VIGS体系中的应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)能够诱导靶基因瞬时沉默从而应用于植物基因功能的研究，然而目前在颠茄上的VIGS的体系尚未建立。病毒诱导的基因沉默目前已经广泛应用于植物基因功能的研究。该技术主要是以植物病毒为载体，导入靶基因的部分序列后，采用注射含病毒载体的菌体入植物细胞后，导入序列会与靶基因mRNA形成双链最终导致靶基因降解，从而起到了基因沉默的作用。

发明内容

鉴于此，本发明解决的技术问题是，本发明提供了一种在颠茄中实现瞬时基因沉默的VIGS体系，为研究颠茄基因功能提供了重要的技术支持。

本发明在传统中药材颠茄中建立了病毒诱导的VIGS体系。从颠茄中克隆了编码八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase,PDS)基因，通过VIGS技术在颠茄中实现了PDS基因表达沉默，从而抑制了颠茄叶绿素的生物合成，最终导致了叶片出现漂白现象。本发明首次克隆AbPDS基因并建立了颠茄的VIGS体系，为研究颠茄基因的生物学功能提供了可靠的技术保障。

本发明采用的技术方案是：一种颠茄AbPDS基因，其DNA序列为SEQ ID NO.1。

上述颠茄AbPDS基因，由DNA序列为SEQ ID NO.2和DNA序列为SEQ ID NO.3的上游引物和下游引物，进行PCR扩增获得。

PCR扩增的体系如下：

PCR程序为：95℃,3min→(95℃，变性30s→58℃，退火30s→72℃，延伸1min)×35循环→72℃，5min。

本发明所述AbPDS基因抑制叶绿素合成，用于构建VIGS体系。所述VIGS体系的构建步骤如下：

选择AbPDS基因中的770-bp片段克隆至pTRV2中，构建pTRV2-AbPDS重组质粒；pTRV2-AbPDS重组质粒是将所述AbPDS基因中的770-bp片段和TRV2质粒分别用SacI和KpnI进行双酶切；再通过T4连接酶进行连接获得的。

分别将TRV1以及TRV2-AbPDS重组质粒转化进入农杆菌GV3101；

用TRV1+TRV2-AbPDS转化的农杆菌GV3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

用分光光度法测定VIGS介导的AbPDS沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qPCR分析AbPDS基因的表达水平验证VIGS效果。

本发明获得了颠茄AbPDS基因，验证了AbPDS基因的沉默具有抑制叶绿素合成的作用，为颠茄VIGS体系的建立提供了重要的对照基因；颠茄VIGS体系的构建有助于研究颠茄基因的生物学功能。

附图说明

图1为VIGS沉默AbPDS导致的漂白结果图；

图2为颠茄叶绿素含量图；

图3为AbPDS基因表达水平示意图。