[发明专利]枯草芽孢杆菌swrC基因作为乳酸菌筛选标记的应用

权利要求书

1.枯草芽孢杆菌swrC基因作为乳酸菌筛选标记的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，具体步骤如下：

1)载体构建

通过融合PCR将乳酸菌组成型启动子序列与swrC基因序列连接，再利用一步克隆试剂盒，将该融合片段替换基于抗生素抗性筛选的乳酸菌载体上的抗生素抗性标记，构建swrC筛选载体，将目的基因通过PCR扩增，酶切连接或者一步克隆的方法，克隆至swrC筛选载体的多克隆位点，完成外源蛋白表达载体的构建；

2)载体转化

依据乳酸菌电转化感受态细胞制备条件，制备NZ3900、LP163或者其他相关乳酸菌感受态细胞，取100μL感受态细胞，向其中加入5μg构建好的外源蛋白表达载体，依据电转化条件进行电击转化，加入预冷的电击转化复苏培养基，充分孵育培养后，取100-150μL涂布于含有surfactin浓度为100-250μg/mL的GM17平板，用以进行阳性转化子筛选；

3)转化子筛选

上述转化平板置于30℃培养箱，培养24h后，含有swrC筛选标记的乳酸菌在平板上长出白色圆润的菌落，不含有swrC基因的乳酸菌无法在含有surfactin浓度为100–250μg/mL的GM17平板上生长，挑取阳性转化子，进一步使用swrC基因引物进行PCR验证，验证阳性转化子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，乳酸菌组成型启动子指的是P32、PpepN、PlacA或P170。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，swrC基因指的是枯草芽孢杆菌168来源的swrC基因，或swrC基因相关的密码子优化序列及相关高同源性序列。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，swrC基因指的是枯草芽孢杆菌168来源的swrC基因或swrC基因相关的密码子优化序列及相关高同源性序列。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，乳酸菌指的是乳酸乳球菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌或嗜热链球菌等对surfactin具有抑制活性的乳酸菌。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，乳酸菌指的是乳酸乳球菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌或嗜热链球菌等对surfactin具有抑制活性的乳酸菌。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，乳酸菌指的是乳酸乳球菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌或嗜热链球菌等对surfactin具有抑制活性的乳酸菌。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，乳酸菌指的是乳酸乳球菌，植物乳杆菌，发酵乳杆菌或嗜热链球菌等对surfactin具有抑制活性的乳酸菌。