[发明专利]诱导多能干细胞向运动神经细胞分化的无血清培养体系

说明书

本发明属于干细胞生物学和细胞培养技术领域，提出了促进诱导多能干细胞向运动神经细胞分化的无血清培养体系，具体包括无血清分化基本培养基及促进运动神经细胞分化的添加物。其中，无血清基本培养基必要成分包括：DMEM/F12培养基，人血清白蛋白，L‑谷氨酰胺，D‑葡萄糖，维生素C，N2/B27细胞培养添加剂，非必需氨基酸。促进运动神经细胞分化的添加物具体包括：SB431542，皮啡肽，成纤维生长因子‑2，维甲酸，BDNF，GDNF，CTNF，DAPT，Smoothened激动剂，阿糖胞苷。用此培养基可以帮助提高细胞混合体系中的运动神经细胞分化，减少向其他类型细胞的分化，从而最终得到高纯度的运动神经细胞。

技术领域

本发明属于干细胞生物学和细胞培养技术领域，具体来说，涉及用于一种用于促进诱导多能干细胞向运动神经细胞分化的无血清培养体系。

背景技术

神经变性疾病为一类缓慢起病、病程呈进行性发展、预后不良的疾病，迄今尚缺乏有效的根治方法。临床常见的神经变性疾病有帕金森病、肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩症和阿尔茨海默病等。这些疾病虽病因各异但在病理上均有中枢神经不同部位及不同程度的神经元脱失和功能异常。替代丢失的神经元，使之功能恢复，是治疗这类疾病的新思路。近年来的研究发现体外培养的干细胞不仅可以增殖、分化,而且还可以发生“转分化”，也即一种组织来源的细胞可以分化为其他不相关的组织细胞类型。例如，造血干细胞、间充质干细胞等在一定的体外条件下可以向成熟神经细胞分化。体内实验也证实神经干细胞或非神经组织来源的干细胞移植入受损的脑组织内可以分化为成熟的神经细胞，新生的神经细胞能替代缺失的细胞发挥功能，为这类神经系统难治性疾病提供了新的治疗方法。

在组织学工程和临床治疗中，诱导性多能干细胞理论上可以诱导分化成各类神经细胞，这些细胞可广泛应用于组织神经系统修复与再造萎缩，坏死，缺损的神经元以及神经胶质。而由诱导性干细胞诱导出具有特定神经递质表型的功能性神经元亚型为细胞移植和基因治疗的载体提供了很好的应用手段，对于中枢神经疾病的治疗有着广泛的应用前景。

多能干细胞培养以及向神经细胞分化的培养基中大多含有胎牛血清成分，血清的成分未知而且复杂，由于不同厂家的血清产品批次性差异很大，导致实验的重复性极低。此外，血清还可能携带病原体和其他致病因子，极大降低了分化的神经细胞在药物筛选检测或细胞治疗等方面的应用价值及安全性。

发明内容

本发明的目的是在无血清培养基的基础上，添加一系列物质来促进诱导多能干细胞向运动神经细胞定向分化，可以得到大量的运动神经细胞应用于药物筛选，疾病模型的建立以及干细胞再生医学领域。

本发明的培养基，可将诱导多能干细胞向运动神经细胞分化，抑制未分化细胞以及向其他类型细胞的生长，在分化阶段的后期得到高纯度的运动神经细胞，用于科研领域的研究以及商业应用。

本发明提供了一种促进诱导多能干细胞向运动神经细胞分化的无血清培养体系，具体包括无血清分化基本培养基及促进运动神经细胞分化的添加物。其中，无血清基本培养基，必要成分包括：基础培养基，血清白蛋白，L-谷氨酰胺，D-葡萄糖，维生素C，N2细胞培养添加剂，B27细胞培养添加剂和非必需氨基酸。促进运动神经细胞分化的添加物，具体成分包括：SB431542，皮啡肽，成纤维生长因子-2，维甲酸，脑源性神经营养因子，胶质细胞源性神经营养因子，睫状节神经细胞营养因子，DAPT，Smoothened激动剂，阿糖胞苷。

在一个或多个实施方案中，所述基本培养基中的基础培养基选自DMEM/F12，Neurobasal，RPMI 1640，DMEM和IMDM培养基中的一种或几种。