[发明专利]一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3;5-二烯-7-酮的方法

权利要求书

1.一种利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：是将黑曲霉的发酵菌丝体干燥、磨粉后得菌粉，将菌粉用丙酮提取制得黑曲霉提取液，并将黑曲霉提取液浓缩后制得浸膏，将浸膏层析后即可制得胆甾-3,5-二烯-7-酮；所述的黑曲霉是黑曲霉xj，保藏号为：CCTCC NO：M 206021，名称为：黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。

2.根据权利要求1所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：

1)浸膏的制备：将黑曲霉发酵菌丝体烘干至衡重，然后磨粉，得菌粉，将菌粉用丙酮提取得黑曲霉提取液，并将该提取液浓缩，得浸膏；

2)硅胶柱层析：用石油醚湿法装柱得到硅胶层析柱，将步骤(1)中的浸膏用丙酮溶剂溶解并与硅胶拌样，挥干溶剂后干法上样；用石油醚：丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩；

3)反向柱层析：选取步骤(2)中极性适中浓缩组分用丙酮溶剂溶解与硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上反向硅胶柱，并用纯净水：甲醇梯度洗脱，分段收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，浓缩得目标粗品；

4)再次硅胶柱层析：将步骤(3)中目标粗品再次进行硅胶柱处理；并用石油醚：乙酸乙酯：甲酸洗脱，收集洗脱液，薄层层析跟踪检测，合并相同组分，TLC层析显示为单一组分，浓缩干燥得白色粉末，即得胆甾-3,5-二烯-7-酮。

3.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述步骤1)中，是将黑曲霉发酵菌丝体置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，磨粉，过60目筛得菌粉。

4.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述步骤1)中，菌粉用丙酮以1：4的重量比，在温度50-100℃，压力0-1.0MPa条件下提取3次得黑曲霉提取液，时间为每次3h。

5.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述浓缩是指采用旋转蒸发仪在温度40-60℃、压力为0.04-0.06MPa的条件下旋蒸至有机溶剂挥干。

6.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述与硅胶拌样中的硅胶的尺寸为200-300目。

7.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：步骤2)中，所述的用石油醚：丙酮梯度洗脱是依次按石油醚：丙酮＝1:0、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和0:1进行洗脱。

8.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：步骤3)中，所述的用纯净水：甲醇梯度洗脱是依次按纯净水：甲醇＝100：0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100进行洗脱。

9.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：步骤4)中，所述的用石油醚：乙酸乙酯：甲酸洗脱是按石油醚：乙酸乙酯：甲酸＝8:1：0.001进行洗脱。

10.根据权利要求2所述的利用黑曲霉分离提取胆甾-3,5-二烯-7-酮的方法，其特征在于：所述的洗脱中，洗脱剂的流速为15mL/min。