[发明专利]一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法

说明书

本发明公开了一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法，将处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素处理，收集细胞再加入低渗液处理，用甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制的固定液进行一次预固定和两次固定，滴片及Giemsa染色后观察，放大、拍照、计数。本发明的优点在于通过各参数及制作染色体玻片关键步骤及条件的限定，得到的染色体玻片图片清晰，分散性好，可以清晰的观察到细胞染色体的数目及形态特征，通过对染色体数目及形态特征的分析，来判断杂交瘤细胞遗传的稳定性，利于通过染色体核型分析技术来进一步对杂交瘤细胞的遗传稳定性进行研究。

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞的传代培养，尤其是涉及一种杂交瘤细胞传代培养中染色体的鉴定方法。

背景技术

自1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术以来，科学家们对杂交瘤细胞及单抗的研究就从未间断过。杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化得到的杂交瘤细胞系，所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓的单克隆抗体（monoclonalantibody），简称单抗。但杂交瘤细胞在传代培养过程中，编码抗体的染色体容易丢失，因此对杂交瘤细胞染色体的鉴定就显得尤为必要。

染色体是生物遗传物质基因的载体，是当前研究生物遗传的物质基础。染色体发生异常变化，如数目的增加或较少，甚至是结构的微小变化，如重复、缺失、易位等，均会造成基因的变化，并产生相应的临床表型。而对于杂交瘤细胞而言，染色体的变化可能导致细胞株分泌抗体能力不稳定，甚至丧失产生抗体的能力，尤其是初期建立的杂交瘤细胞，其染色体是很不稳定的。因此在杂交瘤及单抗研究中，细胞遗传分析技术在鉴定杂交瘤、观察细胞株突变、探索抗体特性等方面均具有重要价值。

目前对染色体进行鉴定的方法虽有报道，但缺乏统一的标准，鉴定方法及条件参差不齐，导致难以一次性制备出中期分裂相较多，染色体分散性较好的高清晰度染色体玻片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中期分裂相更多，染色体分散性更好，染色效果更佳的杂交瘤细胞染色体鉴定方法，以满足对杂交瘤细胞进行遗传稳定性研究。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的杂交瘤细胞染色体的鉴定方法包括下述步骤：

第一步，将处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素，调整秋水仙素的最终浓度为0.05μg/ml，37℃、5% CO₂培养箱中培养4小时，使细胞分裂停止在中期相；

第二步，将第一步培养的细胞离心后，去上清液，留细胞沉淀物；

第三步，将第二步得到的细胞沉淀物中加入经37℃预温的0.075M/L KCl低渗液，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；

第四步，按甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制固定液，将该固定液1mL加入第三步得到的细胞悬液中，打匀后离心，去上清液；

第五步，将第四步中的细胞沉淀物中加入5mL上述固定液，轻轻打匀，在室温下静置15min，离心后去上清液；重复该步骤两次；

第六步，将第五步固定处理后的细胞用固定液打匀成细胞悬浮液，按每片2~3滴滴加到已在75%酒精4℃预冷2小时的载玻片上，滴液高度30cm，火焰固定；

第七步，取1份Giemsa原液加入9份pH7.4磷酸缓冲液进行稀释，对第五步制备的载玻片染色20min，用水冲洗后自然干燥，得到标本片；

第八步，将第七步制备好的标本片放在物镜下，显微镜观察，找到细胞分裂中期相，选择分散良好的中期相，放大、拍照、计数。