[发明专利]一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法

权利要求书

1.一种诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体选取和灭菌：将叶片剪成小块，嫩枝剪切成小段，清洗消毒，备用；

(2)诱导胚状愈伤组织培养：将处理好的叶片、嫩枝接种到培养基一上，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生；所述培养基一由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L；

(3)诱导胚状体培养：将步骤(2)得到的愈伤组织转接到培养基二上，暗培养条件下诱导胚状体产生；所述培养基二由MS培养基和GA₃组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述GA₃的浓度为0.1～0.5μmol/L；

(4)体细胞胚胎萌发：将步骤(3)得到的胚状体转接到培养基三上光暗结合培养；所述培养基三由MS培养基、IAA和KT组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L；

(5)成苗：将步骤(4)萌发的胚状体转接到培养基四上光暗结合培养；所述培养基四由MS培养基和PQQ组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述PQQ的浓度为25～200μmol/L；

(6)再生苗的移栽：步骤(5)将生根苗组培瓶拧开，加入少量水，放置1～2天后移栽到装有炼苗基质的炼苗盒中，进行正常水肥管理；

(7)大棚培养：炼苗盒中炼苗两周后移栽到大棚，进行正常水肥管理。

2.根据权利要求1所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)首先将叶片剪成边长为8～12厘米的正方形，嫩枝剪切成长度8～12厘米的小段。

3.根据权利要求2所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，用洗洁精清洗剪取的叶片和嫩枝，去除其表面灰尘、绒毛，再用蒸馏水冲洗，在灭菌的超净工作台上用75％乙醇浸润10s，放到0.1％升汞水溶液中浸透8-10min，用无菌水漂洗3～4次；将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分。

4.根据权利要求3所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分后，进一步用剪刀将叶片剪成0.8～1.2cm²大小的正方形，然后用刀片将叶片划伤；嫩枝斜切成长度0.4～0.6cm的小段，备用。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4)(5)培养时温度均控制在25±1℃。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(4)(5)光暗结合培养时光照强度均为1000～3000Lx，光照时间均为16h/d。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4)(5)中MS培养基中含有蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH5.8。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(6)炼苗所用基质为：椰糠粉：砂石＝1:1，用生根水浇透水，用塑料罩罩住育苗盒，保证育苗盒湿度不低于82％，温度控制25±1℃，光照强度为3000lx，光照时间16h/d条件下培养两周。

9.根据权利要求1所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，

步骤(2)诱导胚状愈伤组织培养的培养基一中：添加剂2,4-D的浓度为0.5μmol/L；所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L的；所述PQQ的浓度为500nmol/L；

步骤(3)诱导胚状体培养的培养基二中：GA₃的浓度为0.3μmol/L；

步骤(4)体细胞胚胎萌发的培养基三中：所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L；

步骤(5)成苗的培养基四中：所述PQQ的浓度为200nmol/L。