[发明专利]一种KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段的单碱基延伸引物；KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标DNA序列，能够有效地对非小细胞肺癌患者展开KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测，为此类患者开展个性化精准诊治奠定临床及科研基础。本发明还涉及一种KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其是涉及一种 KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法及检测试剂盒。

背景技术

KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF都是EGFR下游的信号分子，是众多信号通路上关键的激活因子。这些基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中的突变率分别为20～50％、1～6％、10～30％、8～15％。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变一般会使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。

但现在因缺乏精准、高效的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测手段，进而阻碍了病人治疗用药及临床研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种 KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法和检测试剂盒。

一种KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测方法，包括以下步骤：提取样本DNA；设计用于扩增 KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段的特异性引物；利用单管多重PCR扩增反应得到目标片段；设计用于KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF 基因片段的单碱基延伸引物；KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段单碱基延伸；核酸质谱分析测量目标DNA序列。

进一步地，所述KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段包括 KRAS-1片段、NRAS-2片段、PIK3CA-3片段及BRAF-4片段。

进一步地，所述用于扩增KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因片段的特异性引物包括：用于扩增KRAS-1片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：1或2，反向引物为SEQ ID Nos：3或4；用于扩增NRAS-2片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：5或6，反向引物为SEQID Nos：7或8；用于扩增PIK3CA-3片段的特异性引物，正向引物为：SEQ ID Nos：9或10，反向引物为SEQ ID Nos： 11或12；用于扩增BRAF-4片段的特异性引物，正向引物为：SEQ IDNos：13或14，反向引物为SEQ ID Nos：15或16。

进一步地，所述用于KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合片段的单碱基延伸引物包括：用于KRAS-1片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：61；用于NRAS-2片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：62；用于PIK3CA-3片段的单碱基延伸引物，序列为SEQID Nos：63；用于BRAF-4片段的单碱基延伸引物，序列为SEQ ID Nos：64。

进一步地，所述利用单管多重PCR扩增反应包括以下步骤：Taq 酶激活，DNA变性。

进一步地，Taq酶激活时温度为95℃。

进一步地，Taq酶激活时间为15分钟。

进一步地，DNA变性时温度为95℃。

进一步地，DNA变性时间为15秒。