[发明专利]一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用

说明书

本申请公开了一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。本申请的纯化方法，包括采用阴离子交换树脂对水溶性菁染料偶联物进行吸附，使其与不带电荷或者带正电荷的杂质分离，再分别采用水和不同盐离子浓度的溶液对吸附水溶性菁染料偶联物的阴离子交换树脂进行洗脱，分段接收目标成份，获得纯化的水溶性菁染料偶联物。本申请的纯化方法，利用阴离子交换树脂的吸附/解吸附分离纯化偶联物，溶解样品可以用水，降低了样品前处理难度，也减少了样品被污染的概率，利于工业化规模生产。利用阴离子交换树脂吸附分离，更方便快捷，成本低、效率高。在洗脱时流动相采用水和盐溶液即可，避免了使用有机溶剂对环境的污染。

技术领域

本申请涉及水溶性菁染料偶联物纯化领域，特别是涉及一种水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。

背景技术

荧光染料，在吸收紫外线或可见光后，能把短波长的光转化为长波长的可见光发射出来，呈现闪亮的颜色，例如，酸性曙红、荧光黄、红汞以及某些分散染料等。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。

菁染料是一类性能优良的荧光标记染料，包括Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7等一系列不对称的水溶性荧光分子。它们的摩尔吸光系数很高，具有良好的稳定性，被广泛用于蛋白、抗体、核酸及其它生物分子的标记和检测。目前，Cy3和Cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物。另外，Cy系列的染料，其吸收在近红外区，背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料，特别适合用来替代放射性元素，在活体小动物体内成像。

由于菁染料激发波长在600-1000nm的近红外区，可以有效的避免被标记物自荧光的干扰。水溶性菁染料偶联物是指水溶性菁与一段linker连接后形成的水溶性的偶联物；其中，水溶性菁可以是水溶性的Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，linker根据不同的使用需求而定，例如可以是聚乙二醇、炔丙基胺或者3-叠氮丙基-1-胺等。以比较常见的Cy5为例，在基因测序时，一般将水溶性Cy5染料连接一段聚乙二醇(缩写PEG)linker，然后连接到基因芯片上。又例如，可以利用共价键将水溶性菁染料与linker相连，当作特异性的荧光探针来使用，其中的linker可以采用炔丙基胺或者3-叠氮丙基-1-胺等。另外，Cy5是目前测序中最常使用的一种荧光染料，例如将Cy5通过linker连接到G碱基上，利用碱基互补配对原则，在酶的作用下，将带有荧光染料的核苷酸结合到待测序列上，然后通过荧光信号读取碱基信息。以上这些水溶性菁染料Cy5偶联物，统一简称为Cy5-linker或Cy5偶联物。所有依赖于Cy5偶联物的技术中，Cy5偶联物的纯度都是其技术实现或者有效实施的关键，也是限制这些技术的瓶颈。所以对于水溶性菁染料Cy5偶联物的纯化至关重要。同样的，Cy3偶联物、Cy5.5偶联物和Cy7偶联物的纯度也是限制其应用的重要因素。

菁染料与linker连接反应的副反应多，副产物极性相近，产物的分离提纯相当困难。由于水溶性的菁染料分子极性大，使得分离提纯越加困难。目前通常采用制备型的HPLC进行分离纯化，该方法需要用到昂贵的制备型HPLC、制备柱和HPLC级的洗脱剂，设备十分昂贵，投入巨大。其中，HPLC级的洗脱剂一般由水和HPLC级的乙腈组成；而HPLC级的乙腈价格昂贵，且对环境有污染。并且，制备型的HPLC分离纯化的通量很小，不利于工业化生产。同样以Cy5为例，对于Cy5偶联物来说，Cy5与Cy5偶联物的极性相当，采用制备型的HPLC分离纯化，要通过多次过HPLC制备柱才能实现分离，成本高、效率低。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的水溶性菁染料偶联物的纯化方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：