[发明专利]标准曲线法荧光定量PCR鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物

说明书

本发明公开了一种标准曲线法荧光定量PCR鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物。它是利用实时荧光定量PCR法，以已经构建完成的转牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(野生型)为检测对象。分别检测已转牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(野生型)，可直接检出待测样品其是否转入牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc基因及其转基因拷贝数。为转基因牛遗传稳定性筛选实验奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种标准曲线法荧光定量PCR鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物。

背景技术

转基因动物是通过各种实验方法，将已知的外源性基因导入动物基因组内并使之整合到染色体上，且外源性基因能稳定地遗传给后代的动物。外源基因拷贝数定量检测是了解和评价转基因动物的重要内容之一。通过对转基因动物进行早期检测，及时了解转基因动物的基本特征，为转基因动物的后期培育和开发利用提供评价基础，避免人力、物力、财力的浪费。传统外源基因拷贝数的检测方法是Southern blot，但耗时、费力、并需要大量基因组DNA。实时荧光定量PCR技术是近年来迅速发展的DNA/RNA定量技术，与Southernblot相比具有高特异性、高信噪比、高安全性、高效率、高通量、低成本等优点，已被广泛应用于转基因外源基因拷贝数的检测。

王晓建(2007)等报道，利用实时荧光定量PCR检测CARK转基因小鼠，整个过程在2h内即可完成，3只小鼠的外源基因拷贝数分别为1，17和45，与Southern杂交的结果完全一致，3次重复实验的△Ct非常稳定，SD仅为0.15～0.46。杨继山(2010)等报道利用实时荧光定量PCR检测抗凝血酶III转基因山羊外源基因拷贝数，通过对外源基因 ATIII和内参基因GAPDH作标准曲线，分别得到ATIII和GAPDH的标准曲线方程，计算出转ATIII基因山羊外源基因拷贝数。李振林(2013)等报道利用实时荧光定量检测 nestin-GFP转基因小鼠外源基因整合拷贝数，转基因小鼠GFP基因和nestin基因表达一致，通过实时荧光定量PCR检测转基因小鼠GFP基因拷贝数，得到转基因小鼠外源基因拷贝数分别为3和4。Taverniers(2005)报道，利用实时荧光定量PCR检测4种转基因动物，发现该方法的准确性完全可与Southern杂交结果相匹配。

发明内容

本发明的目的在于提供一种标准曲线法荧光定量PCR鉴定牛转基因拷贝数的方法及引物。它是利用实时荧光定量PCR法，以已经构建完成的转牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(野生型)为检测对象。所转入的Oct4、Sox2、Klf4、cMyc基因属牛本身的基因，故在检测引物设计时加上一段外源载体基因序列，则可直接检测是否转入牛源四因子Oct4、Sox2、 Klf4、cMyc基因及其转基因拷贝数。本发明采用标准曲线法荧光定量PCR先做出牛源四因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc转基因拷贝数标准曲线。分别检测已转牛源四因子Oct4、 Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(转基因型)及未转牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc牛体细胞(野生型)，可直接检出待测样品其是否转入牛源4因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc 基因及其转基因拷贝数。为转基因牛遗传稳定性筛选实验奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种标准曲线法荧光定量PCR鉴定牛转基因拷贝数的引物，包括内参基因GAPDH荧光定量PCR反应使用的引物对SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2、待测基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc荧光定量PCR反应使用的引物对SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10，引物设计参数为引物长度18-25bp，Tm55-65℃，其中每对检测引物的上游引物Tm值和下游引物Tm值相差不大于4℃，产物大小为100-300bp。