[发明专利]一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗

说明书

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。利用本发明所述方法培养的LMH细胞用于禽腺病毒4型的培养，可在极大地降低生产成本的同时保证病毒的效价，该工艺在较短的时间60h内，即可稳定获得滴度10^8.5TCID₅₀/0.1ml以上的禽腺病毒4型病毒，与现有技术相比具有明显的技术优势。用高滴度的疫苗抗原制备的疫苗可显著提高疫苗的免疫力，经免疫攻毒试验结果证明，对禽腺病毒4型攻击可100％保护。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。

背景技术

禽腺病毒4(FAV-4)型具备高致病性的特点，可直接引发心包积液-肝炎综合征，目前针对高致病性的FAV-4，疫苗是有效的防控措施。

常规的培养FAV-4病毒多采用鸡胚成纤维细胞、鸡肝肾细胞、雏鸡肾细胞、鸡胚肝细胞4种原代细胞，但原代肝肾细胞存在制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备过程中易混入鸡胚成纤维细胞，不利于试验操作。

1981年，一位日本学者通过使用二乙基亚硝胺对雄性鸡进行诱导产生肝癌，从肝癌组织分离得到一株鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)，且有相关报道可以将该细胞系用于病毒培养。如中国专利申请CN105420198A，发明人利用鸡肝癌细胞作为鸭瘟病毒的宿主，证明了鸡肝癌细胞用于培养病毒的可行性。除此之外，也有利用LMH细胞培养禽腺病毒4型的报道，但是均存在培养条件复杂，成本较高，且病毒滴度较现有技术无明显技术优势。

鸡传染性法氏囊病是呼肠弧病毒引起的一种雏鸡急性、接触性传染病。该病具有发病突然、病程短、死亡率高的特点，且可引起鸡体免疫抑制，是传统养鸡业的主要传染病之一。

H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现为轻度的呼吸道症状，采食量减少，产蛋率降低，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失，更重要的，H9亚型禽流感病毒还可以感染人，对人类健康存在严重的威胁。

鸡城新疫俗称鸡瘟，是由鸡城新疫病毒引起的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有高发病率和病死率的特点，在世界各地均有发生，一旦爆发将给养殖业带来毁灭性的打击。

目前市场上已有利用LMH细胞系生产的针对禽腺病毒4(FAV-4)和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，以及针对鸡城新疫、禽腺病毒4(FAV-4)和H9亚型禽流感病毒的三联疫苗，但较现有技术并无明显的优势，普遍存在生产成本高缺点，疫苗的攻毒保护力仍有待提高的空间。

由此，有必要提供一种满足以下特点的LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法：

-其LMH细胞和病毒培养条件简单，易于操作；

-其病毒培养时间短；

-其病毒滴度高；

-其生产成本低。

发明内容

本发明旨在提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗，该生产工艺培养条件简单，成本低，病毒培养时间短，病毒滴度高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：

S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；