[发明专利]基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物

说明书

本发明公开了基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，上游引物为：5'‑TCTGGCTCTTAGGCTTCG‑3'，下游引物为：5'‑GTTGTCTTCCTGGCTGTT‑3'。基于该特异性引物扩增快速鉴别菲牛蛭的方法，主要步骤如下：（1）对待测样品进行总DNA的提取，得到提取的基因组DNA；（2）以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应扩增；（3）对步骤（2）所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对菲牛蛭的特异性鉴别，为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物。

背景技术

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)俗称金边蚂蟥，别名马尼拟医蛭，其化学成分主要有多种脂肪酸、氨基酸及微量元素等，有效成分主要是水蛭素、菲牛蛭素A、菲牛蛭素B，除此之外菲牛蛭还含有一些其他的生物活性成分，如抗凝多肽、纤维蛋白溶解酶、透明质酸酶、血管扩张剂、抗血小板聚集活性成分、抑菌活性成分等。菲牛蛭的药理作用主要有抗血小板聚集与抗凝血作用，抑制血栓形成作用，降脂作用，抗肿瘤作用，促进血管新生作用，综合菲牛蛭的有效成分、药理作用、作用机制以及分子生物学相关资料为进一步开发利用菲牛蛭奠定了基础，菲牛蛭作为一种新型药物出现，为防治心血管疾病，尤其为高脂血症患者带来曙光。

不同水蛭品种的活性成分及药效活性往往存在差异，以宽体金线蛭和菲牛蛭为例，两者的活性成分有很大区别，且菲牛蛭比目前广泛应用的宽体金线蛭具有更优的药效活性。菲牛蛭又称金边蚂蟥，其身体两侧的金边为其鉴定特征，但是菲牛蛭死后及其干品金边消失，不易分辨、鉴定，市场上水蛭品种杂多，其中不乏一些进口水蛭药材品种，如何将菲牛蛭与其它品种区分开来，对于合理使用菲牛蛭至关重要。

云南省于2013年将菲牛蛭收录到《云南省中药材标准》中，广西壮族自治区的壮药二卷中也收录了菲牛蛭，推动了菲牛蛭药材的标准化进程。目前，对于菲牛蛭品种的鉴别方法主要有垂直平板十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，基因序列及分子进化分析法等。

目前，对菲牛蛭药材的鉴定方法主要依靠性状鉴别和分子生物学鉴定手段，性状鉴别对鉴定人员的专业性要求很高，且不同炮制方法、储存条件都会给菲牛蛭药材的鉴定带来较大困难，目前的分子生物学鉴定手段为DNA条形码的方法，需将通用引物的扩增产物进行测序，并对测序序列进行比对分析，耗时较长，并且要求操作人员熟悉分子生物专业知识并熟悉专业软件的使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，有效得将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分，为菲牛蛭的分子生物学鉴定方法提供了参考。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

基于分子生物学方法鉴别菲牛蛭的特异性引物，其特征在于，上游引物为：5'-TCTGGCTCTTAGGCTTCG-3'，下游引物为：5'-GTTGTCTTCCTGGCTGTT-3'。

上述引物在快速鉴别菲牛蛭中的应用。

本发明还提供一种采用上述引物快速鉴别菲牛蛭的方法，主要步骤如下：

(1)对待测样品进行总DNA的提取，得到提取的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用上述上游引物、下游引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；

(3)对步骤(2)所得反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成像，实现对菲牛蛭的特异性鉴别。