[发明专利]一种分离和纯化外泌体的方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，是一种分离和纯化外泌体的方法。从样品中分离获得含杂蛋白的外泌体悬液，利用羟基磷灰石分离纯化获得纯外泌体。本发明方法操作简单便捷、成本低，可快速高效地获得高纯度的外泌体颗粒，便于外泌体的蛋白质分析、外泌体DNA/RNA的提取、外泌体电镜分析、外泌体粒径分析等下游实验。具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，是一种分离和纯化外泌体的方法。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种含有复杂的蛋白质、脂质和核酸等活性生物分子的具有质膜双分子层结构的微囊泡，直径约为30-150nm，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，免疫抗原呈递，神经递质传递，脂类代谢及细胞信号转导等过程，并与多种疾病的发生、发展、治疗及预后密切相关。所以很多科研人员对外泌体的研究兴趣也日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。开发从细胞培养液或生物流体分离外泌体的有效的方法可以让研究者更好地了解微囊泡的成分。超速离心作为传统并有效的分离外泌体的方法，其复杂的操作流程，昂贵的仪器设备，限制了外泌体的下游研究。目前市场上也有一些外泌体提取试剂盒，多数采用多聚物沉淀，也有采用密度梯度离心的，然而，这样提取的外泌体，都包含很多杂蛋白。因此，去除杂蛋白是目前提取外泌体需要迫切解决的问题。专利(一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法)中有阐述利用羟基磷灰石进行尺寸排阻色谱法进行分离，其经过不同浓度的磷酸盐进行梯度洗脱从而得到不同的集分，获取不同亚群的外泌体并对其进行分析，但其获取不同亚群的外泌体重悬液含大量杂蛋白，并非为纯净的外泌体，仅为含外泌体的混合液，因此现急需一种获得纯净的外泌体的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有外泌体分离技术的缺陷和不足，提供一种分离和纯化外泌体的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种分离和纯化外泌体的方法，从样品中分离获得含杂蛋白的外泌体悬液，利用羟基磷灰石分离纯化获得纯外泌体。

进一步的说，将含杂蛋白的外泌体悬液加入装有羟基磷灰石的纯化柱中，混匀摇动孵育20-60min后，用含有磷酸二氢钠的NaCl溶液洗涤1-3次；然后利用高浓度的磷酸二氢钠溶液洗脱，得到的洗脱液即为纯净的的外泌体溶液。

所述洗涤液为含有磷酸二氢钠的500mM NaCl溶液,其中磷酸二氢钠浓度为10mM。

所述洗脱时高浓度的磷酸二氢钠溶液浓度为10mM-200mM。

所述含杂蛋白的外泌体悬液与羟基磷灰石体积质量(ul/mg)比为5-7：1。

所述样品为细胞培养液、人体外血清、血浆或尿液。

所述含杂蛋白的外泌体悬液从细胞培养液样品中获得时：细胞培养液在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取淀试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；

从生物体液样品中获得时：尿液样品在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；

从人体外血清、血浆样品中获得时，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液。

所述外泌体沉淀的重悬试剂为10mM的NaH₂PO₄。

再进一步的说基于羟基磷灰石分离和纯化外泌体的方法，主要包括如下步骤：