[发明专利]一种鉴定西瓜炭疽病抗性的SSR引物及方法

权利要求书

1.一种鉴定西瓜炭疽病抗性的SSR引物，其特征在于：所述SSR引物，其正向引物为5’-AGAGGAATGTGGTAATGAATAAACATCT-3’，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示；其反向引物为5’-AATTGGCCCAAATATCCATATGAC-3’，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.一种采用如权利要求1所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的SSR引物鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：

提取待测西瓜样品的DNA；

使用荧光标记的SSR引物对提取出的待测西瓜样品的DNA进行PCR扩增；

对PCR扩增产物进行毛细管电泳荧光检测，根据检测结果判断西瓜是否具有炭疽病抗性。

3.如权利要求2所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：所述提取待测西瓜样品的DNA，具体包括以下步骤：

将待测西瓜样品置于离心管中，加入液氮，用组织捣碎仪打碎待测样品；

向离心管中加入十六烷基三甲基溴化铵CTAB预热缓冲液，水浴，再加入氯仿-异戊醇，混匀离心；

吸取上清液加入装有异丙醇的离心管中，混匀离心；

弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤沉淀，干燥后加入双蒸水。

4.如权利要求3所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：用组织捣碎仪打碎待测样品之前，在待测样品上撒上二乙基二硫代氨基甲酸DIECA晶体。

5.如权利要求3所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：水浴前，向离心管中加入活性炭。

6.如权利要求2所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：所述使用SSR引物对提取出的待测西瓜样品的DNA进行PCR扩增，包括以下步骤：

在PCR管中加入脱氧核糖核苷三磷酸、荧光标记的正向引物和反向引物、TaqDNA聚合酶、含Mg²⁺的PCR缓冲液，待测西瓜样品的DNA和双蒸水，混匀后置于PCR仪上进行PCR扩增。

7.如权利要求6所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应流程包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共34个循环；72℃延伸10min，4℃保存待用。

8.如权利要求2所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：所述对PCR扩增产物进行毛细管电泳荧光检测，根据毛细管电泳荧光检测结果判断西瓜是否具有炭疽病抗性，具体包括以下步骤：

将6-FAM荧光标记、HEX荧光标记的PCR扩增产物分别用超纯水稀释30倍，将TAMRA荧光标记、ROX荧光标记的PCR扩增产物分别用超纯水稀释10倍；

分别取等体积的上述4种PCR扩增产物稀释后的溶液混合制得混合液，将混合液加入DNA分析仪专用深孔板中，向DNA分析仪专用深孔板中各孔分别加入LIZ500分子量内标和去离子甲酰胺；

在PCR分析仪上95℃变性，取出冷却，瞬时离心后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测；

使用DNA分析仪的片段分析软件进行图像分析，并将毛细管电泳数据制成电泳检测图谱；根据电泳检测图谱判断西瓜是否具有炭疽病抗性。

9.如权利要求2所述的鉴定西瓜炭疽病抗性的方法，其特征在于：所述待测西瓜样品包括抗病亲本与感病亲本，以及两者杂交后代。