[发明专利]甲醇生物转化菌株的构建方法以及构建的菌株和应用

说明书

本发明公开了构建甲醇快速利用菌株的方法，首先构建甲醇和木糖强制共利用的基础菌株。其次以甲醇和木糖为碳源对上述基础菌株进行适应性进化，获得生长速度显著加快的菌株。最后增强菌株中核酮糖‑5‑磷酸的下游代谢途径相关酶的活性。本发明还公开了构建的甲醇生物转化菌株以及利用所述菌株进行甲醇生物转化的方法。利用本发明的菌株能够以甲醇和木糖为碳源，甚至以甲醇为唯一碳源进行甲醇生物转化，并且甲醇的转化效率显著提高。本发明还公开了本发明菌株中一些酶的突变体，以及利用这些突变体进行甲醇生物转化的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及提高菌株的甲醇生物转化效率的方法、这种方法获得的菌株以及这种方法和获得的菌株在生物转化甲醇中的应用。

背景技术

甲醇是一种液态的一碳资源，是煤炭化工、页岩气化工和工农业废弃物气化的初级平台产品，也是重要的化工原料。甲醇的合成方法多样，来源广泛，既可以利用煤炭和天然气等石化资源作为原料，也可以利用生物质资源如农业废弃物秸秆、城市有机垃圾、工业有机废弃物如有机废渣和钢厂尾气，或二氧化碳作为原料。丰富的原料来源，保证了甲醇的供给。2015年中国甲醇产能超过5000万吨/年，并以每年10％-20％的速度持续增长。目前，我国甲醇产能已达8000万吨/年，占国际总量50％以上，呈现过剩趋势。开发甲醇高值转化技术对于延伸甲醇产业链、缓解产能过剩、增加产业附加值、培育新兴甲醇经济具有重要的战略意义，成为当前甲醇化工亟待发展的领域(陈继军,陈光达,2016；张世新等,2013)。

中国化学法甲醇转化技术在国际上拥有领先的地位，近年来甲醇制烯烃等关键技术取得了突破并在工业上推广实施，初步展示了甲醇经济的美好前景。但是目前甲醇化学转化能够获得的产品种类还比较少，产品碳链较短，结构较为简单。相比与化学转化，甲醇生物转化具有产品多样、产品选择性高和过程绿色环保等特点，可以合成复杂多样的长碳链产品。因此，开发甲醇生物转化方法，发展基于甲醇的生物制造产业，具有重要意义。目前国内甲醇价格约为2000元/吨，远低于常用生物质原料葡萄糖的价格(3000元/吨以上)，且甲醇的平均碳原子还原程度(κ，degree of reduction per carbon)高达6，比常用生物质原料葡萄糖(κ＝4)、木糖(κ＝4)和甘油(κ＝4.7)均高，甲醇可为生物合成化学品提供大量的还原力，可大幅提高产物的转化率。因此，甲醇有望成为生物发酵、生物制造产业的新原料平台。

由于甲醇生物转化的重要意义，近年来学术界和工业界投入大量的人力物力研究甲醇生物转化途径，以及开发可利用甲醇作为唯一碳源的平台菌株。自然界中虽然存在可利用甲醇的天然微生物，但是其生长速度慢，甲醇利用效率低，且由于缺乏遗传改造工具，难以对这些天然微生物进行代谢工程改造，极大的限制了甲醇生物转化利用。但是，研究者从这些天然微生物中，发现了多条甲醇生物转化途径，例如核酮糖单磷酸途径(RuMP途径)、木酮糖单磷酸途径、核酮糖二磷酸途径和丝氨酸循环等。其中，RuMP途径是目前研究和应用较多的甲醇生物转化途径。在RuMP途径中，甲醇首先被甲醇脱氢酶(Mdh)氧化成甲醛，甲醛与核酮糖-5-磷酸(Ru5P)在3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)的催化下生成己酮糖-6-磷酸(H6P)，H6P被6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi)催化生成果糖-6-磷酸(F6P)，F6P进入糖酵解途径被利用，或通过戊糖磷酸途径进行碳重排再生Ru5P(Whitaker,W.B.,Sandoval,N.R.,Bennett,R.K.,Fast,A.G.,Papoutsakis,E.T.,2015.Synthetic methylotrophy:engineering the production of biofuels and chemicals based on the biology ofaerobic methanol utilization.Curr.Opin.Biotechnol.33,165-175)。