[发明专利]表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Rab23基因敲除

说明书

本发明提供了一种采用CRISPR‑Cas系统针对表皮干细胞进行RAB23基因编辑，特别是涉及一种构建RAB23基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立，用于皮肤鳞癌的后续研究。其中构建并获得了一个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPR/Cas9针对RAB23的基因编辑效率。本发明提供的表皮干细胞RAB23敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-Cas系统针对表皮干细胞进行RAB23基因编辑，特别是涉及一种构建RAB23基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。

背景技术

表皮干细胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transit amplifying cellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiatedcells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，10：45-54.Papini etal.stem cells，2003，21：481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liang et al，stem cells，2002：20：21-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。

人类多能干细胞(Human pluripotent stem cells,hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/Cas9)技术的飞速发展。

Rab23是RAS原癌基因成员，其编码的蛋白是小GTP酶超家族Rab家族成员，其突变可引起小鼠开脑综合征(open brain syndrome)，因此又称为opb基因。2001年，Eggenschwile:等研究发现，Rab23是Sonic Hedgehog信号通路必要的负调控因子，而近几年，Rab23作为原癌基因的作用越来越被学者重视。研究发现，Rab23参与肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、和甲状腺癌的发生发展，并在胃癌中首次发现与肿瘤侵袭密切相关。

其中特别是皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,c SCC)是一种起源于表皮、皮肤附属器、以及复层扁平上皮角质形成细胞的恶性肿瘤,发病占皮肤恶性肿瘤的16％,仅次于基底细胞癌,光线性角化病、鲍温病及角化棘皮瘤均能导致角质形成细胞的恶性增殖。c SCC具有侵袭性,可发生早期转移。因此,鳞状细胞癌的高转移、易侵袭性是威胁全球人民的公共健康问题,进一步研究皮肤鳞癌侵袭机制,转移以及增值的分子机制,具有重要的价值和深远的意义。而Rab23在鳞癌中高表达,且与鳞癌分化负相关；Transwell实验证实Rab23显著促进鳞癌细胞侵袭,并调控侵袭关键分子Rac1的表达。

基于表皮干细胞的多能性，为了研究敲除RAB23基因的表皮干细胞在皮肤鳞状细胞癌治疗方面的功能，建立敲除RAB23基因的表皮干细胞细胞系变得尤为重要。

发明内容