[发明专利]大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法

说明书

本发明公开了一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，涉及蔷薇属植物形状改良的基因工程领域，包括确定接种时期、配制侵染液、病毒载体的接种、接种后处理、基因沉默效率检验五个步骤，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至OD₆₀₀为1.5‑2.0，保证了在自然条件下接种区域内携带病毒载体的农杆菌具有足够的存活基数，提高了整个实验的侵染效率；在侵染液配制中加入低浓度Silwet‑77组分，既增加了植物材料表面的亲水性，提高了侵染液的侵染效率，同时低浓度的组分不会对植物材料产生毒害作用，且其污染率低，有利于环保；本方法既节省了成本又提高了基因沉默效率，处理样本的的基因沉默效率达到87.5%以上。

技术领域

本发明涉及蔷薇属植物形状改良的基因工程领域，具体地说是一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法。

背景技术

病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。当携带含有内源基因片段的病毒载体侵染寄主植物后，能够激活植物自身的免疫系统：在识别并降解病毒RNA的同时也会产生含内源目的基因的microRNA，这些 microRNA与靶基因的mRNA结合，之后被Dicer酶降解，从而使目的基因表达水平下降或功能丧失。正是利用这一点，可以完成对未知基因相关功能的验证。其中由人工改良后的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默，以其沉默效率高、持续时间长（30-40天左右），寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。即便如此，TRV病毒诱导的基因沉默还是被最多的应用到茄科和十字花科等一系列草本植物的研究中去。当前，还未曾有以大田条件下多年生的蔷薇属植株为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系研究的报道。

蔷薇属的某些植物（如玫瑰）有着巨大的科研价值，而目前已有的病毒诱导基因沉默的技术操作在上述条件下的蔷薇属植物上并不适用，因此以其为对象建立一种优化的、高效的病毒诱导基因沉默体系尤为重要。而在病毒选择（TRV）和嵌入病毒的靶基因片段都是最优的条件下，在构建好带有靶基因的重组病毒载体后，介导转化农杆菌的活性、侵染液的配制、病毒载体的接种技术、接种时期、接种后培养植物材料的光温条件等因素才是影响病毒诱导基因沉默体系能否成功建立的关键。

发明内容

为解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种以大田条件下多年生的蔷薇属植株为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系的方法，简单高效，成本低廉，易于在室外运行。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种大田蔷薇属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，通过如下步骤实现：

1）确定接种时期：3月中旬至4月中旬期间，接种时间为下午3点以后，提前查看天气预报，接种后一周之内确保无降雨；

2）配制侵染液：侵染液现用现配，配制过程如下：

首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于5mlLB或YEB液体培养基中，该培养基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml， 28℃条件下, 200r/min震荡10-12h至浑独而不泛白；

其次，分别再用50mlLB或YEB液体培养基培养，该培养基中含有kan 50ug/ml、利福平100ug/ml、 MES 10mM、AS 200uM ，28℃条件下震荡，在菌液浓度达到OD₆₀₀为1.5-2.0时取出；

然后，离心收集菌体，均用25ml侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以1/2MS液体培养基作为溶剂，其中含有MES 10mM、AS 100uM、MgC12 10mM，调节菌液浓度OD₆₀₀到1.5-2.0，形成农杆菌侵染缓冲液；