[发明专利]一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法

说明书

本发明涉及一种分离高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法，包括以下步骤：S1将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液离心取上清经过孔径为0.45μm的滤膜过滤，调节滤液pH，得到待纯化样品液；S2将待纯化样品液经阴离子交换层析，得到高纯度猪圆环全病毒疫苗。用本发明的层析方法纯化猪圆环全病毒疫苗的纯化效率提高数百倍，节省了生产成本，且工艺简单稳定，易于快速放大生产。

技术领域

本发明涉及疫苗分离纯化领域，具体涉及一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法。

背景技术

猪圆环病毒有两个血清型PCV-1和PCV-2，其中PCV-1为非致病性的病毒，PCV-2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。近年来，随着动物疫苗在疾病预防中的地位日益重要，很多企业把研究力量投入到新的疫苗生产工艺上，对疫苗质量要求也日益提高。猪圆环疫苗评价指标中，除抗原含量外，应激反应是另一重要指标。猪圆环全病毒疫苗多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒，灭活后得到全病毒疫苗。现有分离纯化猪圆环全病毒的生产工艺为凝胶过滤层析，根据病毒颗粒与杂质分子量的差异，采用4FF或6FF等凝胶过滤介质进行组分分离，从而达到分离猪圆环全病毒目的。凝胶过滤介质的层析工艺回收率约为80％，缺点是纯化前需将抗原进行20倍以上的浓缩且浓缩过程中抗原损失约为20％；层析填料用量大，上样量不能超过层析介质体积的10％，纯化效率非常低，纯化成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效低成本的分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法，包括以下步骤：

S1:将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液离心，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，调节滤液pH，得到待纯化样品液；

S2:将待纯化样品液经阴离子交换层析，得到高纯度猪圆环全病毒疫苗。

进一步，所述步骤S1中滤液的pH为6～9。

进一步，所述阴离子交换层析为强阴离子交换层析。

进一步，所述强阴离子交换层析使用的填料为Q Focurose 6FF、Q Focurose 6XL、Q Focurose HPR或Q Focurose HPL。

进一步，所述离子交换层析的具体步骤为：

S21:采用10～15倍柱体积的pH为6～9的50mM的磷酸盐缓冲液,以1～2mL/min的流速平衡层析柱；

S22：以步骤S1提取的待纯化样品液作为上样样品，其中样品电导为5～15ms/cm，上样完成后用pH为6～9的50mM的磷酸盐缓冲液清洗，流速为1～2mL/min，所收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗；

S23：用含有1M NaCl的pH为6～9的磷酸盐缓冲液以1～2mL/min的流速洗脱，所收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等。

本发明的优点：本发明的分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法根据猪圆环全病毒和杂质的分子量大小、等电点等较大差异将猪圆环全病毒中的杂质蛋白、色素和内毒素等杂质吸附于大孔径阴离子层析介质，猪圆环全病毒通过上柱直接流穿，一步纯化得到猪圆环全病毒。本发明的层析方法上样量为传统凝胶过滤层析的数百倍，纯化效率提高了数百倍，降低了层析介质的使用量和层析设备的规格，节省了大量生产成本；本发明的层析方法对上游悬浮培养工艺稳定性要求低，直接通过调整样品中的电导和pH在一定范围内保持下游纯化工艺稳定性；本发明的层析方法工艺简单稳定，易于快速放大生产。

附图说明

图1为本发明实施例1的纯化图谱图；

图2为本发明实施例2的纯化图谱图；