[发明专利]构建DNA甲基化文库的方法及其应用

权利要求书

1.一种构建DNA甲基化文库的方法，其特征在于，包括：

对DNA样本进行重亚硫酸盐转化处理，以便获得经过重硫酸盐转化后的单链DNA分子；

通过线性扩增，在所述单链DNA分子的两端分别连接上第一接头序列和第二接头序列，以便获得经接头序列连接的DNA分子；

利用所述经接头序列连接的DNA分子构建DNA甲基化文库；

进一步包括：

对所述单链DNA分子进行第一线性扩增，以便在所述单链DNA分子的一端连接上所述第一接头序列，获得连接有第一接头序列的DNA分子；

对所述连接有第一接头序列的DNA分子进行第二线性扩增，以便在所述连接有第一接头序列的DNA分子的另一端连接上所述第二接头序列，获得所述经接头序列连接的DNA分子；

进一步包括：

将所述经接头序列连接的DNA分子进行PCR扩增，以便得到PCR扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头序列和所述第二接头序列中均含有分子标签序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分子标签序列为8~12nt随机核酸序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分子标签序列为8~10nt随机核酸序列。

5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一接头序列和所述第二接头序列进一步含有PCR扩增引物互补序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分别利用Klenow片段以及phi29 DNA聚合酶进行所述第一线性扩增和所述第二线性扩增。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述单链DNA分子和所述第一接头序列混合，在90~100摄氏度下反应2~5分钟，在30~35摄氏度下反应5~10分钟，然后加入Klenow片段和phi29 DNA聚合酶，在30~35摄氏度下反应30~60分钟，得到连接有第一接头序列的DNA分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述连接有第一接头序列的DNA分子和所述第二接头序列混合，在90~100摄氏度下反应2~5分钟，在30~35摄氏度下反应5~10分钟，然后加入Klenow片段和phi29 DNA聚合酶，在30~35摄氏度下反应30~60分钟，得到所述经接头序列连接的DNA分子。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA样本为ctDNA样本。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，向所述ctDNA中加入λDNA，然后进行重亚硫酸盐处理。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述ctDNA和所述λDNA的质量比为1:（20~50）。

12.根据权利要求9~11任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA的含量为1~15ng。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述DNA的含量为5~15ng。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：

将所述PCR扩增产物变性为单链DNA，并将所述单链DNA环化成环状单链DNA。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，进一步包括，使用核酸外切酶消化未环化的单链DNA。