[发明专利]提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF及其制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体通过增生大肠杆菌的内膜进行，本发明还公开了一种质粒pCDAF，通过大量表达ATP合酶b亚基基因atpF促使大肠杆菌内膜增生，本发明还公开了该质粒pCDAF的制备和使用方法。本发明的技术方案，通过表达ATP合酶b亚基基因atpF促使细胞内膜增生使角鲨烯及其合成前体物的储存空间增加，最终提高角鲨烯的积累量，通过质粒pCDAF用于促使大肠杆菌中内膜的增生，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7控制ATP合酶b亚基基因atpF的表达以提高其表达量。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量的方法，还涉及一种提升大肠杆菌角鲨烯含量用质粒pCDAF，还涉及一种该pCDAF的制备方法，还涉及一种该质粒pCDAF的使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)作为模式菌，具有研究透彻、易改造、易培养等特点，是发酵生产活性化合物的理想菌之一。目前，通过大肠杆菌已经生产出青蒿素、类胡萝卜素等多种活性物质。然而，大肠杆菌由于缺乏角鲨烯合酶，不能天然合成角鲨烯。前期申请人通过引入外源角鲨烯合酶成功构建大肠杆菌E.coli CSQ1使其能够合成角鲨烯，然而大肠杆菌E.coli CSQ1中角鲨烯的含量较低，离工业化生产要求尚有较大差距。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过大肠杆菌内膜增生来提高角鲨烯及其合成前体物的贮存空间，以此提高细胞内角鲨烯的积累量。

本发明的第二个目的是提供一种质粒pCDAF，通过大量表达ATP合酶b亚基基因atpF促使大肠杆菌内膜增生。

本发明的第三个目的是提供一种该质粒pCDAF的制备方法，用于制备质粒pCDAF。

本发明的第四个目的是提供一种利用pCDAF提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pCDAF促使大肠杆菌合成角鲨烯。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，通过增生大肠杆菌的内膜进行；所述大肠杆菌为可合成角鲨烯的大肠杆菌E.coli CSQ1，所述大肠杆菌E.coli CSQ1是先通过将野生菌株E.coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞后，再通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得的，所述质粒pTsqs的核苷酸序列表如序列1所示。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pCDAF，用于增生权利要求1所述大肠杆菌的内膜，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和ATP合酶b亚基基因atpF，ATP合酶b亚基基因atpF上游具有PT7启动子以启动ATP合酶b亚基基因atpF的表达；所述质粒pCDAF的核苷酸序列如序列2所示。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的第三种技术方案是，一种质粒pCDAF的制备方法，具体按照以下步骤实施：