[发明专利]提高沼泽红假单胞菌角鲨烯含量用质粒及制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，其原理是通过敲除沼泽红假单胞菌的基因crtB来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。本发明开公开了一种质粒pkCRLR以及该质粒pkCRLR的制备和使用方法，用于实现敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB，进而提高高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，还涉及一种用于敲除基因crtB的质粒pkCRLR，还涉及一种该质粒pkCRLR的制备和使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，且价格昂贵。该方法具有周期长、成本高、破坏环境等缺点。因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。因此，亟需新的生产菌株及提高角鲨烯含量的新方法。

近年来，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)基因组测序完成，使得采用代谢工程技术对其进行改造成为可能。由于Rhodopseudomonas palustris(R.palustris)富含多种生物活性物质，对其进行分子生物学改造相关研究越来越多。前期申请人通过敲除沼泽红假单胞中的shc基因，得到重组菌R.palustris(Δshc)，其原理是阻断角鲨烯下游合成途径使角鲨烯含量提高了27倍。然而，重组菌R.palustris(Δshc)中的角鲨烯产量尚未达到工业化生产水平。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，用于实现提高其角鲨烯的合成。

本发明的第二个目的是提供一种质粒pkCRLR，用于敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB。

本发明的第三个目的是提供一种该质粒pkCRLR的制备方法，用以实现质粒pkCRLR的制备。

本发明的第四个目的是提供一种质粒pkCRLR的使用方法，用于如何使用质粒pkCRLR敲除重组菌R.palustris(Δshc)中的基因crtB。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提高沼泽红假单胞菌中角鲨烯含量的方法，通过敲除沼泽红假单胞菌的基因crtB来阻断类胡萝卜素的合成途径实现，所述沼泽红假单胞菌为敲除了shc基因后得到的重组菌R.palustris(Δshc)。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pkCRLR，用于敲除权利要求1所述基因crtB，包括载体pk18mobsacB，载体pk18mobsacB内插入有根据基因crtB上下游序列设计的上游同源臂CRL与下游同源臂CRR、大肠杆菌复制起始位点oriV、卡那霉素抗性筛选标记以及蔗糖敏感基因sacB；所述质粒pkCRLR的核苷酸序列如序列1所示，所述基因crtB的核苷酸序列如序列2所示，所述上游同源臂CRL的核苷酸序列如序列3所示，所述下游同源臂CRR的核苷酸序列如序列3所示。

为了达到上述第三个目的，本发明所采用的技术方案是，一种质粒pkCRLR的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，根据重组菌R.palustris(Δshc)中基因crtB及其上下游序列，设计两对引物，以基因组为模板，通过菌落PCR获得基因crtB的扩增的上游同源臂CRL和下游同源臂CRR；