[发明专利]一种外源片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法

说明书

本发明属于病毒基因重组技术领域，具体涉及利用非同源重组机制，将外源DNA片段定点、定向地高效插入特定大型DNA病毒基因组。本发明包括下列步骤：1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR‑Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR‑associated protein 9)系统；2)设计并构建携带一个及以上相同切割位点的外源基因供体；3)将CRISPR‑Cas9系统表达载体和外源基因供体按照一定比例和顺序导入特定细胞；4)经过一段时间，根据病毒特性，选择合适的感染时间点和感染复数，将病毒感染细胞；5)选择优化的时间点收集病毒感染后产生的子代重组病毒；6)分离、筛选和鉴定目标重组子代DNA病毒。利用该方法能够显著提高外源基因定点定向插入DNA病毒基因组的重组效率，进而缩短重组病毒的构建和筛选时间。

技术领域

本发明属于病毒基因组重组技术领域，特别是针对双链DNA病毒，具体涉及利用一种不依赖于同源重组的高保真方法，将外源基因片段高效地定向插入较大的DNA病毒基因组，可用于病毒感染机制研究、外源基因表达、病毒载体构建、减毒疫苗及溶瘤病毒构建等应用。

背景技术

现有的构建重组DNA病毒的方法主要有两种：第一种方式，是通过将DNA病毒全基因组通过细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)的形式，稳定保存在大肠杆菌中，而后可以在体外利用核酸内切酶、大肠杆菌内的同源重组修饰或者基因整合系统如Cre-loxP等方式进行基因修饰操作。该重组方法可以将病毒基因组以质粒的形式稳定保存且较为方便的进行编辑，但其也有一定的限制性，如体内修饰的过程依赖合适的限制性内切酶，或者需要特定的重组位点。此外，利用细菌人工染色体进行构建，也需要一定的筛选步骤，并且还需要对重组病毒进行拯救，因此需要长时间大工作量的多轮操作才能获得重组DNA病毒。第二种方式则利用细胞内源性的同源重组机制，将构建的带有病毒基因组同源序列的外源基因供体质粒，与DNA病毒基因组共同导入受体细胞，通过细胞内自发频率极低的同源重组机制，从而将目的外源基因重组到病毒基因组中。但是，由于同源重组较低的发生频率，利用细胞内源同源重组进行外源基因插入的效率很低，往往低于0.1％，这样将会给突变体或者重组病毒的构建带来相当大的工作量和相当长的挑选周期。

在申请号为CN201410041906.8，公开日为2014年04月30日的名称为“一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法”的发明专利申请中公开了一种能够高效地将外源基因插入DNA病毒基因组的定点改造方法，该方法利用CRISPR-Cas9系统与同源重组机制结合，显著提升了将外源基因插入DNA病毒基因组的效率(可达到8％)，但是该改造方法的仍有提升空间，且对于大片段外源基因，其插入效率常常随着片段长度增加而下降，因此无法满足高效插入外源基因，尤其是大片段外源基因的需要。

发明内容

本发明的目的：采用非同源重组的方法提供一种外源片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，相对于同源重组，进一步提高了外源片段的插入效率，同时有显著降低了非同源重组技术插入外源片段易导致接头处突变的倾向。

本发明所采用的技术解决方案是：

一种外源片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特殊之处在于：包括下列步骤：

1、一种外源基因片段高效定点定向插入DNA病毒基因组的方法，其特征在于包括下列步骤：

1)设计并构建针对DNA病毒基因组特定切割位点的CRISPR-Cas9(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein9)系统；

2)设计并构建携带有1个及以上能够被相同CRISPR-Cas9系统识别的定向切割位点和外源基因片段组成的供体系统；