[发明专利]一种河豚毒素标准生物样品的制备方法

说明书

本发明公开了一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。这种制备方法是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。本发明从TTX提取、纯化和制备纯品方面切入，以织纹螺为原料，并通过乙酸甲醇提取、大体积碳纳米管固相萃取净化粗提液，后将毒液浓缩，用制备高效液相进样进行纯化制备。本发明样品制备方法与过程操作简便、高效，适用于批量生产、工艺化制备河豚毒素标准生物样品。

技术领域

本发明涉及一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。

背景技术

河鲀毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性极强的非蛋白类神经毒素，存在于河鲀(Tetraodontidae)和其它多种海洋生物体内。其作为镇痛药物和麻醉剂，在医药上用途广泛，水产动物源食品检测领域也需要TTX标准品。由于在净化和制备技术和工艺上存在难点，高纯度的TTX标准品供不应求。TTX制备主要依靠从生物材料中提取的方法获取，经过多步的纯化与浓缩步骤，从而获取高纯度的产品。

传统的TTX标准样品制备流程多以河鲀鱼的内脏作为提取原料，用酸性溶剂提取，经过多种层析法除去杂质，结合多次重结晶和浓缩步骤获取高纯度的TTX产品。崔建洲等用醋酸水溶液提取河鲀肝脏中的TTX，采用D201和IR-86两种离子交换树脂对粗提取液进行净化处理，Sephadex G-10葡聚糖凝胶除去蛋白质成分，用HPLC对粗品进行分离纯化，得到纯度为99.5％的TTX产品。国内也有易瑞灶和陈伟珠借助膜分离技术，用HPLC进行纯品分离制备，得到纯度为99％和97％的TTX产品。此外，还有利用海藻希瓦氏菌和梭形芽孢杆菌的细菌发酵法获取TTX产品。该方法可避免因获取原料而大量捕杀野生河鲀的问题，同时避免了对河鲀资源和生态平衡造成的破坏，且不受季节和地域的限制，但是利用细菌生产的TTX含量低，目前实际生产中难以大规模应用。

TTX的化学结构比较复杂(见附图1)，人工合成存在较大难度，目前有关人工合成TTX技术的研究不多。日本学者Kishi等于1972年首次研究了人工合成外消旋TTX，此后又有立体选择性合成和不对称合成TTX的人工合成方法的报道出现。

发明内容

本发明的目的在于针对现有TTX标准品制备工艺上存在技术的缺陷和难点，高纯度的TTX标准品供不应求的情况，提供一种高纯度的河豚毒素生物标准样品的制备方法，该方法制备过程与操作简单、高效，适用河豚毒素织纹螺生物标准样品的批量制备和生产。

本发明所采取的技术方案是：

一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。

这种河豚毒素标准生物样品的制备方法，包括以下步骤：

1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；

2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节pH，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；

3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节pH，冷冻干燥至析出结晶，即河豚毒素标准生物样品。

制备方法的步骤1)中，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶(5～6)。

制备方法的步骤1)中，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为0.5％～1.5％。