[发明专利]一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，保藏编号为CGMCC No.15819。

2.权利要求1所述的生产肝素酶的大肠埃希氏菌的构建方法，包括以下步骤：

1)提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；

所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQ ID No.2所示的序列；

2)以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；

所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.3所示的序列，所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列；

3)将所述步骤1)得到的肝素酶基因与所述步骤2)得到的质粒基因通过GibsonAssembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒pBENT-H1转化到大肠埃希氏菌中，得到生产肝素酶的大肠埃希氏菌；

所述步骤1)和2)没有时间顺序限定。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系每50μL包括：100ng/μL的全基因组DNA 1μL、10μM的肝素酶基因上游引物0.5μL、10μM的肝素酶基因下游引物0.5μL、PCR Premix酶25μL和ddH₂O 8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃10s；72℃5min；4℃10min；35个循环。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)PCR扩增的体系每50μL包括：浓度为47.5ng/μL的质粒DNA 1μL、浓度为10μM的质粒上游引物0.5μL、浓度为10μM的质粒下游引物0.5μL、PCR Premix酶25μL和ddH₂O 8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃5min；72℃5min；4℃10min；35个循环。

5.根据权利要求2～4任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)连接的体系每20μL包括：Gibson Mast Mix 10μL、浓度为19.9ng/μL的肝素酶基因1μL、浓度为37.4ng/μL的质粒pBENT 6μL和ddH₂O 3μL；

所述连接的条件包括：50℃反应15min。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)转化的条件包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在0～4℃下静置40～50min，再37～45℃热激20～40s，然后在0～4℃下静置3～7min；

所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌的体积比为(1～3):(90～110)。

7.权利要求1所述的生产肝素酶的大肠埃希氏菌或权利要求2～6任意一项构建方法构建得到的生产肝素酶的大肠埃希氏菌在生产肝素酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生产肝素酶的方法包括以下步骤：

1)将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于发酵培养基中，使得到的发酵初始混合物的OD₆₀₀值为0.2～0.3；

2)将所述步骤1)得到的发酵初始混合物在35～37℃下振荡培养2～3h，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物与异丙基硫代半乳糖苷混合，得到含有异丙基硫代半乳糖苷混合物，将所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物在15～18℃下振荡培养7～9h，得到肝素酶；所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为250～300μM。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤1)发酵培养基以水为溶剂，每升包括：10～15g胰蛋白胨、5～10g酵母提取物和10～15g氯化钠，所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。