[发明专利]具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法

说明书

本发明提供一种具有吡啶‑联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法，属于均相荧光免疫分析技术领域。该螯合剂的结构式如式1所示。所述的结构为吡啶‑二(2,2‑联吡啶)结构,在吡啶4位上引入单蛋白质连接基团，该结构有利于提高发光效率，减少标记物荧光淬灭；该螯合剂穴状结构具有热稳定性和动力学螯合稳定性。本发明还提供一种具有吡啶‑联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂的制备方法。本发明的螯合剂激发光谱波长范围为258‑356nm，最大激发波长为331nm；铕离子特征的荧光光谱峰593、616nm(⁵D₀‑⁷F₁,⁵D₀‑⁷F₂能级跃迁)，荧光寿命大于500μs。

技术领域

本发明属于均相荧光免疫分析技术领域，具体涉及一种具有吡啶-联吡啶穴 状结构的荧光免疫分析螯合剂及其制备方法。

背景技术

均相时间分辨免疫分析技术-ELISA的替代技术，无需洗涤、两步操作，具 有无可比拟的优势,操作非常简单：空板直接加样，加完即可检测；体系非常稳 定：7天之内可随时检测，信号基本不变；数据客观真实：可有效去除背景荧 光，假阳性率、假阴性率低。

均相时间分辨荧光免疫分析技术结合了荧光共振能量转移(FRET， FluorescenceResonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF，Time Resolved Fluorescence))两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的Eu元素 的螯合标记物和XL665作为一个供体(Donor)，是基于Eu穴状化合物的供体 与受体(第二荧光标记物)之间的荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能 量转移中，受体的发射的荧光寿命与供体的发射荧光的寿命相同。因为含Eu供 体的荧光衰减时间较长，会诱导XL665受体长时间地发射荧光，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很 容易区分出FRET信号。

均相时间分辨荧光免疫分析技术是基于TR-FRET技术，它使用了镧系离 子标记化合物，具有长的荧光寿命，大的Stroke’s shift；同时，镧系离子穴状 物(Cryptate)与其它螯合物结构(Chelate)相比，显著增加了稳定性。

将一个稀土阳离子纳入到立体笼中的穴状结构,可收集光然后将能量转 移到核心的镧系离子,大环的性质形成异常稳固的复合体。穴能耐受一些特殊的 实验条件如大量存在的阳离子(Mg²⁺和Mn²⁺等)、螯合物(EDTA)、溶剂或 者温度。从均相时间分辨荧光免疫分析技术能应用到临床诊断就能看出它也适 用于浓度高的血清(50％)。在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大 量化合物的抗干扰性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按 照需要的次数去读，进行动力学检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合 剂及其制备方法，该螯合剂穴状结构具有热稳定性和动力学螯合稳定性，荧光 寿命长。

本发明首先提供一种具有吡啶-联吡啶穴状结构的荧光免疫分析螯合剂，该 螯合剂的结构式如式1所示：

其中，R₁选自OH、

n选自1～10的整数；

R₂、R₃彼此独立地选自H、取代或未取代的烷基、烷氧基、卤素、取代或 未取代的氨基、硝基、取代或未取代的酰胺基、羧基、酯基、取代或未取代的 吡咯烷二酮。

优选的是，所述的R₂、R₃彼此独立地选自H、甲氧基、氨基、羧基或吡咯 烷二酮。