[发明专利]携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于，通过切除腺相关病毒中病毒包装识别位点内全部基因，插入MAGE-A4抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到重组腺相关病毒载体；

其中，突变位点为135位和136位，分别由谷氨酸突变为谷氨酰胺，甲硫氨酸突变为异亮氨酸；

所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的是p5启动子，猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。

2.一种含有权利要求1所述携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

3.制备权利要求1所述携带MAGE-A4突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

S2：逆转录PCR后，扩增得到MAGE-A4核心致癌cDNA；

S3：将步骤S2中MAGE-A4 cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和MAGE-A4基因的重组腺相关病毒载体；

S4：使用点突变PCR技术，将MAGE-A4基因突变为MAGE-A4 E135Q M136I突变抗原基因；

S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中包括以下步骤：

1)从表达MAGE-A4的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；

2)以所述总cDNA为模板，用引物1：ATGTCTTCTGAGCAGAAGAGTCAGCACTGCA和引物2：TCAGACTCCCTCTTCCTCCTCTAACAAAGCTGCTTCA扩增得到MAGE-A4野生型基因。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤S4的操作方法为：使用引物3：GTCACAAAGGCAGATATACTGGAGAGAGTC进行点突变PCR，将135位和136位的谷氨酸和甲硫氨酸突变为谷氨酰胺和异亮氨酸突变抗原基因。

6.一种用于肿瘤的细胞免疫治疗的药物，其特征在于：活性成分为权利要求1所述的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，或者由权利要求3～5任一项所述的制备方法制得的重组腺相关病毒载体，或权利要求2所述的含有携带MAGE-A4突变抗原的重组腺相关病毒载体的产品。

7.一种权利要求1所述的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤的免疫药物中的应用。