[发明专利]鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用

权利要求书

1.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，其特征在于：所述引物的序列如下：

上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’

下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。

2.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：

利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。

3.根据权利要求2所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；

(2)PCR扩增反应：

利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以步骤(1)得到的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；所述引物对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA均可扩增，扩增条带大小均为459bp；

(3)PCR产物的酶切：

将步骤(2)扩增的PCR产物进行SpeⅠ酶切反应；

(4)琼脂糖凝胶电泳：

对步骤(3)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；鸭腺病毒C型的DNA扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段，即大小为459bp的片段；对于鸭腺病毒B型的DNA和鸭腺病毒C型的DNA混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳可显示3条片段，其中1条大小为459bp的片段是鸭腺病毒C型的DNA经PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物；另2条片段是鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物，且2条片段中，1条大小为286bp，另1条大小为173bp。

4.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增反应的优化体系为：在50μL体系中含有以下成分：

5.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃10min；10℃hold。

6.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(3)所述酶切反应的体系为：在30μL体系中含有以下成分：

7.根据权利要求3所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：步骤(3)所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5min。

8.根据权利要求1所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，其特征在于：在制备区分鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型试剂盒上的应用。

9.根据权利要求1所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，其特征在于：在检测鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型感染情况方面的应用。