[发明专利]一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法

权利要求书

1.一种获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将含有丙酮酸氧化酶的表达基因的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至固体培养基上，在第一预定温度下培养第一预定时间后活化，得到活化的重组大肠杆菌pET28a-pod；

步骤2，将所述活化的重组大肠杆菌pET28a-pod接种至LB培养基，而后将该LB培养基放置于摇床上，在第二预定温度下以第一速度摇动第二预定时间，得到所述活化的重组大肠杆菌pET28a-pod的种子液；

步骤3，接种一定量的所述种子液至TB培养基，在第三预定温度下将所述种子液培养至所述种子液的浓度为第一细胞浓度后加入诱导剂进行诱导，在第四预定温度下以第二速度摇动第三预定时间直至浓度为第二细胞浓度，而后不断加入盐酸溶液进行发酵直至pH值为5.5-6.5，然后继续诱导，得到菌液I；

步骤4，取一定质量的所述菌液I在第五预定温度下离心第四预定时间后倒去上清液，而后用PBS溶液洗涤两次，再用等体积的所述PBS溶液进行重悬，得到重悬液；

步骤5，将所述重悬液置于超声变幅杆中进行超声破碎，得到超声破碎后的菌液II；

步骤6，取一定质量的菌液II在第六预定温度下离心第五预定时间后，收集含有所述丙酮酸氧化酶的上清液。

2.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤1中的所述固体培养基的成分为5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨、1.0％氯化钠以及2.0％琼脂粉，

所述第一预定温度为37℃，所述第一预定时间为12h。

3.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤2中的所述LB培养基的成分为0.5％酵母粉、1.0％胰蛋白胨以及1.0％氯化钠，

所述第二预定温度为37℃，第一速度为200rpm，第二预定时间为12h。

4.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤3中的所述TB培养基的成分为2.4％酵母粉、1.2％胰蛋白动、0.4％甘油、0.23％磷酸二氢钾以及1.7％磷酸氢二钾，

所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，

所述种子液的接种量为所述种子液的总量的5％，所述第三预定温度为37℃，所述第一细胞浓度为7.5×10⁷-8.8×10⁷cfu/mL，所述第四预定温度为20-30℃，所述第二速度为200rpm，所述第三预定时间为12-20h，所述第二细胞浓度为0.1-1.0mmol/L，所述盐酸溶液的浓度为2mol/L。

5.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤4中的所述菌液I的所述一定质量为12000g，所述第五预定温度为4℃，所述第四预定时间5min，所述PBS溶液的浓度为0.1mol/L，所述PBS溶液的pH值为6.8。

6.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤5中的所述超声变幅杆的直径为2mm，所述超声破碎的超声功率为150W。

7.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤5中的进行超声破碎包括如下子步骤：

将所述重悬液置于所述超声变幅杆中，开启超声破碎，超声4s后，停歇6s，如此重复直至进行所述超声破碎的总时间满3min后关闭超声破碎，得到超声破碎后的所述菌液II。

8.根据权利要求1所述的获取重组大肠杆菌中丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于：

其中，所述步骤6中的所述菌液II的所述一定质量为12000g，所述第六预定温度为4℃，所述第五预定时间为5min。