[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP试剂盒包括2×反应液12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL,环引物LF、LB 20μmol/L各1.0μL，外引物F3、B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶0.8μL，逆转录酶0.2μL，荧光染料0.5μL。所述试剂盒的检测方法，包括步骤：1)提取病毒核酸模板；2)将荧光LAMP反应体系与2.0μL的病毒核酸模板混合，补水至25μL，并加入20.0μL的封闭液；3)通过Real‑Time PCR System设定保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，40个循环；于63℃45s处收集荧光信号。其猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒反应时间比Taqman荧光PCR法可缩短20min以上。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性肠道传染病，以呕吐和水样腹泻为主要特征，各年龄段和各品种的猪均易感，对幼龄仔猪致死率高；PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，病毒核酸为正义单链RNA，基因组全长约28kb，主要结构蛋白为纤突糖蛋白(S蛋白)、小膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。

该病于1978年在英国首次被报道，后世界各国均有发现。中国于1980年首次报道该病。2010年下半年，PED在中国各地再次大规模暴发，且临床症状较之前严重，仔猪病死率达100％，仅中国南部10省就有过百万头仔猪发病死亡，给养猪业带来重大损失。腹泻流行期间，多数发病猪场都采取了各种防治措施，如选用中国已商品化的PEDV/PGEV二联腹泻苗或国外引进的弱毒疫苗进行疫苗接种，使用各类抗生素或中药制剂对病猪进行药物治疗，采集病猪粪便经处理后进行反饲治疗等，但防治效果均不理想。其次，PEDV与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌等肠道感染疾病的临床症状和病理变化相似，只能通过实验室检验进行确诊。

目前，国内外主要通过细胞培养、免疫学和动物实验、分子生物学等方法对病毒进行鉴别诊断，传统的方法存在检测周期长、灵敏度低的缺点，不适用于临床快速诊断和大规模的流行病学调查，而新兴的分子生物学具有灵敏、快捷等特点，在现代动物疫病的流行病学调查和预防中起到了不可替代的关键作用中。2000年，日本学者Notomi在《NucleicAcids Res》公开发表了一种适用于基因诊断的新型恒温核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，受到了WHO和各国的广泛关注。2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社受WHO委托完成了甲型H1N1流感LAMP试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病的快速蔓延起到积极作用。目前，LAMP技术已成功应用于SARS、禽流感、HIV等疾病，也广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫疾病的快速诊断和食品化妆品的快速检测，得到诸多欧美国家的认同。

发明内容

本发明旨在提供提供一种对PEDV灵敏、特异的荧光LAMP引物组。

本发明所采取的技术方案是：

一种猪流行性腹泻病毒荧光LAMP引物组，包括引物FIP、BIP、F3、B3、LF和LB，各引物的序列如SEQ ID№1～6所示。

上述引物组可应用于猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒。

所述猪流行性腹泻病毒荧光LAMP检测试剂盒，具有LAMP反应体系，包括：