[发明专利]一种刺五加目的基因SSR分子标记的筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种刺五加目的基因SSR分子标记的筛选方法及应用，筛选方法具体步骤为：1)分别提取刺五加各组织的总RNA；2)总RNA反转录后进行RNA‑seq测序，Trinity软件进行unigene组装；3)筛选出与刺五加皂苷、SOD等合成积累相关的unigene，MicroSatellite软件筛选这些unigene上的SSR位点；4)Primer3.0软件设计引物，并合成；5)基因组DNA为模板进行PCR扩增；6)PCR产物进行电泳检测，开发目的基因SSR引物。本发明高效、更有针对性的开发与目的性状相关的候选SSR分子标记，为优良刺五加种质资源的分子鉴定提供有效标记。对优良刺五加种质资源早期鉴定和加快育种进程具有重要意义。

技术领域

本发明属于刺五加分子标记开发、分子生物技术领域，本发明涉及一种刺五加目的基因SSR分子标记的筛选方法及应用。

背景技术

刺五加为五加科五加属落叶灌木，果实富含超氧化歧化酶(SOD)，其具有良好的清除自由基和抗氧化功能；根皮富含皂苷、鞣质、亚麻酸和多种维生素等。果实和根部均可入药，具有增强人体免疫力，祛风湿、强筋骨的功效。刺五加主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北和山西，近年来，其种植面积逐渐扩大。在刺五加培育和推广中，刺五加果实品质参差不齐，急需优良种质的分子鉴定方法，为高生物活性成分刺五加良种筛选提供科学依据。

微卫星标记(Simple Sequence Repeats Marker，SSR)广泛分布于植物基因组中的不同目的基因上，重复性和稳定性较好。SSR标记已应用在植物遗传图谱构建、多样性分析和分子标记辅助育种等方面。以往，无参考基因组的植物，在开发SSR分子标记时常采用EST序列，需要从大量引物中筛选和验证与性状连锁的SSR标记，工作量大而且具有不确定性和盲目性。目前，未见基于RNA-seq技术开发刺五加目的基因SSR分子标记方面的报道。

发明内容

为了克服现有RNA-seq SSR分子标记筛选方法所具有的工作量大、不确定性和盲目性的不足，本发明提供一种刺五加目的基因SSR分子标记的筛选方法，本发明利用刺五加果实、根、茎和叶的RNA-seq数据开发目的基因SSR分子标记，利用unigene具有基因功能注释且含有SSR位点的特点，克服了现有技术筛选SSR标记的不确定性、盲目性的缺点，有针对性的补充与刺五加品质相关的候选SSR分子标记，进而为刺五加种质资源多样性分析和性状关联分析提供有效标记，也为优良种质资源早期筛选提供分子依据。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

1.分别提取刺五加果实、根、茎和叶的总RNA，等量混合不同组织器官的总RNA；

2.将上述总RNA样品反转录后，进行RNA-seq测序，并利用Trinity软件进行unigene组装；

3.重点利用unigene的基因功能注释，筛选与刺五加皂苷、SOD、维生素、糖、酸、脂肪酸等合成积累相关的unigene，并利用MicroSatellite软件筛选这些unigene上的SSR位点；

4.根据目的基因SSR位点两端互补序列，利用Primer3.0软件设计引物，并合成；

5.以刺五加叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增；

6.PCR产物进行电泳检测，筛选符合预期产物大小且条带清晰的目的基因SSR引物。

进一步的，所述步骤3中unigene注释包括Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG公共数据库的功能注释。利用KAAS功能将unigene映射到KEGG数据库获得代谢途径信息。根据复杂且数量较多的unigene注释信息，筛选出与目的性状相关且含有SSR位点的unigene(目的基因)，进而更有针对性的设计并开发与目的性状相关的目的基因SSR引物，为刺五加种质的性状关联分析提供候选SSR分子标记。