[发明专利]一种痰液液化及核酸保护试剂

说明书

本发明提供了一种液化痰液同时有效保护样本核酸的试剂，由胍类、半胱氨酸衍生物和高分子惰性颗粒组成，其中胍类为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；半胱氨酸衍生物为半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、高半胱氨酸、甲基半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种或多种；高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒、聚乙烯颗粒、聚氯乙烯颗粒、聚苯乙烯颗粒中的一种或多种。本发明试剂为粉末和颗粒混合的固体，能够较好地渗入痰液样本中，充分混匀痰液样本，从而实现痰液充分液化，同时本发明涉及的试剂能够在常温条件下长效保护痰液样本中的核酸不被降解。本发明涉及的试剂成分简单且成本低，生产工艺简易，使用操作简单，非常适合在临床广泛使用。

技术领域

本方法属于用于医学检测的样本处理及保存技术领域，涉及一种痰液液化及核酸保护试剂，技术关键在于促进样本液化以及保护样本中的核酸不被降解。

背景技术

痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外，正常人痰很少，只是保持呼吸道湿润而分泌的少量粘液。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道就会分泌增加，痰量就会增加，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前较精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。随着荧光定量PCR以及多重PCR技术在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。

痰液样本具有粘度大、蛋白多、成分复杂等特点，痰液包含粘蛋白和其他多种蛋白(如免疫蛋白)、多种酶类、脱落细胞、微生物及其他吸入杂质等。由于痰液粘稠度大，不便于直接检测，临床上痰液样本的检测需要先对痰液进行液化处理，目的是释放黏蛋白，降低痰液粘度。常见的痰液液化方法为氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60-80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。DTT(二硫苏糖醇)法是目前最常用的痰液液化方法，利用含巯基(-SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等固定细胞。该方法耗时长，且使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且DTT稳定性差，需要在低温条件下保存，同时DTT存在一定的毒性，不适合临床上大批量处理痰液样本。此外，由于痰液样本粘度大，常规液化处理过程中易产生混合不均的问题。

痰液样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。然而在临床检测中，往往不能及时处理和检测痰液样本中的核酸，因此发明一种能够快速充分液化痰液同时有效保护样本核酸的方法十分必要。目前已公开的关于痰液液化及核酸保护的发明较多。然而，这些方法普遍存在成分复杂、成本高、样本混匀及液化不充分等问题。

目前已公开的相似专利为中国专利申请文件CN104232621A公开的《一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法》，该专利描述的消化液同时具有液化痰液和保存核酸的功能，但是该消化液的组成复杂，成本较高，且处理后的痰液样本只能低温条件下有效保存。其他发明专利仅单独涉及痰液液化或痰液核酸保护，例如：中国专利申请文件CN205020193U公开的《痰液旋转研磨均质液化装置》均匀机械法液化痰液，不仅装置成本高，还无法有效保护样本核酸不被降解；中国专利申请文件CN104263721A公开的《一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法》主要存在以下不足：其专利所述，仅在痰纸上浸润了的核酸保护液，浸润的保护液含量有限，不能保证痰液样本与核酸保护液充分接触，对痰液中核酸的保护效果一般。