[发明专利]一种低成本的超分辨显微镜

说明书

本发明涉及一种低成本的超分辨显微镜，包括激光发射器及沿激光发射器发射激光光路设置的中心密度滤波器、第一凸透镜、散射片、第二凸透镜、第三凸透镜、双色镜、物镜、激发光滤波器、平场透镜和CMOS图像传感器；本发明利用工业级的二极管激光器、低数值孔径的物镜和工业级的相机在基本保证显微镜分辨率的条件下，很好地解决了成本问题，让超分辨技术能够得到更为广泛的应用，更好的推进科学的发展。

技术领域

本发明属于光学技术领域，涉及一种低成本的超分辨显微镜。

背景技术

荧光显微镜极大地提高了我们在细胞和亚细胞水平上研究生物过程的能力。然而，由于受到衍射极限的束缚，传统的荧光显微镜的空间分辨率极限大约在200纳米。直至近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到了极大的改进，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。

超分辨技术大致可以分为两类，一种是以受激发射损耗显微镜(STED)和结构光照明显微镜(SIM)为代表的利用非线性光技术实现超分辨。STED的基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率。改变光学点扩散函数来突破光学极限的另一种方法是利用饱和结构照明显微技术(SIM)，其基本原理是将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。但STED和SIM都是基于非线性光学效应，都需要较高功率的脉冲激光，这可能导致损坏样品。并且其光路复杂、设备昂贵，对系统的稳定性要求很高。

另一种是以光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重构显微镜(STORM)为代表的基于单分子定位实现超分辨。其中PALM的基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光分子，在确定这些分子的位置后，再长时间用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使得他们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位，将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术。PALM的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力。

与PALM类似，STORM利用不同的波长控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光。之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离。因此，当Cy3和Cy5偶联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性。将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白。其横向分辨率能够达到20～30nm。

上述这些超分辨技术都使得光学显微镜的分辨率大大提高，但是它们高昂的成本也限制了它们的使用范围，只有少部分相关专业的研究所拥有这些显微镜，大部分研究所和高校都无法承受这样的高成本。

超分辨技术的关键技术要求主要有三个方面，一是需要有一个科研级的激光器作为激光光源，提供平顶光束或者激活特定的荧光分子；二是需要一个高数值孔径的物镜，以收集更多的激发光子，增加成像的对比度，使成像更为清晰；三是需要一个足够灵敏的、高信噪比的光学探头，以收集微弱的荧光信号。这三者使得超分辨显微镜的总费用高达数十万美元。所以亟需研究出一种低成本新的超分辨显微镜很好地解决了成本问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的克服现有技术的缺点和不足，通过对光路的重新设计，采用价格低廉的设备实现超分辨显微技术，提供一种低成本的超分辨显微镜。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：